【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是嚴(yán)重危害人類健康的病原體,其最大的危害性在于HBV慢性持續(xù)性感染易發(fā)展為肝硬化或肝癌。目前臨床上治療HBV的藥物主要有干擾素(interferon,IFN)、核苷類似物(拉米夫定lamivudine等)和免疫調(diào)節(jié)劑等,但這些治療方法僅能降低體內(nèi)的病毒拷貝數(shù),尚不能最終清除體內(nèi)的乙肝病毒。 已有研究表明腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)可以通過(guò)非殺細(xì)胞的機(jī)制抑制HBV的復(fù)制,可能的機(jī)制為T(mén)NF-α激活NF-K B通路進(jìn)而影響病毒核心顆粒的包裝。本室劉曉穎博士利用基因芯片技術(shù)篩選TNFα處理后的HepG2細(xì)胞基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)clAP2 (cellular inhibitor of apoptosis protein 2)蛋白可以被顯著誘導(dǎo),且過(guò)表達(dá)此蛋白能夠抑制HBV的復(fù)制,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)cIAP2能夠下調(diào)HBV RNA水平；鑒于clAP2蛋白為E3連接酶,能介導(dǎo)蛋白降解,因此將表達(dá)clAP2(?)口HBV各編碼蛋白的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)clAP2可以特異性地下調(diào)HBV多聚酶(polymerase)的水平。本課題在此基礎(chǔ)上擬進(jìn)一步明確其分子機(jī)制。 首先通過(guò)過(guò)表達(dá)的方法確認(rèn)了在肝細(xì)胞體系中clAP2可以顯著下調(diào)HBV多聚酶的水平。進(jìn)一步運(yùn)用RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)特異性干擾Huh7和Hela細(xì)胞中內(nèi)源性clAP2蛋白的表達(dá)后,HBV多聚酶水平可得到部分回復(fù)。 鑒于clAP2蛋白由BIR結(jié)構(gòu)域、CARD結(jié)構(gòu)域和RING結(jié)構(gòu)域組成,為了解clAP2下調(diào)多聚酶蛋白水平的結(jié)構(gòu)域,研究中分別構(gòu)建了clAP2蛋白各個(gè)結(jié)構(gòu)域的截短突變體,與HBV多聚酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明clAP2蛋白的BIR2和RING結(jié)構(gòu)域與其下調(diào)多聚酶水平的作用相關(guān)。由于文獻(xiàn)報(bào)道clAP2蛋白的C端RING結(jié)構(gòu)域具有E3連接酶活性,可以促進(jìn)特定的底物泛素化導(dǎo)致底物的降解,進(jìn)一步構(gòu)建了clAP2 E3功能缺失突變質(zhì)粒,將其與HBV多聚酶共轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)此突變體不能下調(diào)多聚酶的表達(dá)水平,提示clAP2下調(diào)多聚酶表達(dá)水平作用和其RING結(jié)構(gòu)域E3連接酶活性相關(guān)。 clAP2若作為HBV多聚酶的E3連接酶,這兩者之間應(yīng)存在著相互作用。為證實(shí)此推測(cè),構(gòu)建了含GST標(biāo)簽蛋白的clAP2及各個(gè)截短體質(zhì)粒并經(jīng)原核誘導(dǎo)表達(dá)及純化。GST-pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示clAP2和HBV多聚酶蛋白在體外有著直接的相互作用,并且這種相互作用由clAP2的BIR2和BIR3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)。同時(shí)免疫熒光實(shí)驗(yàn)提示HBV多聚酶主要定位于細(xì)胞漿,并與clAP2蛋白存在部分共定位。 為檢測(cè)clAP2是否可以作為E3連接酶介導(dǎo)泛素分子連接在HBV多聚酶上并導(dǎo)致其泛素化而降解,進(jìn)一步采用了體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí)clAP2可以促進(jìn)HBV多聚酶的泛素化增強(qiáng)。 已知泛素分子連接到底物上通常有兩種模式：通過(guò)底物內(nèi)部的賴氨酸位點(diǎn)連接或底物的N末端殘基連接。結(jié)合本課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：HBV多聚酶的不穩(wěn)定性主要由于其TP和RH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo),本研究中首先將TP和RH結(jié)構(gòu)域上的賴氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榫彼?結(jié)果顯示突變后的多聚酶仍然能被clAP2降解,提示clAP2介導(dǎo)泛素分子連接HBV多聚酶可能不通過(guò)其內(nèi)部的賴氨酸位點(diǎn)。進(jìn)一步研究表明在HBV多聚酶N末端連接上大分子標(biāo)簽可以使蛋白穩(wěn)定,提示HBV多聚酶的不穩(wěn)定性是由于其N端效應(yīng)造成。 綜上所述,本文首先通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及RNA干擾技術(shù)明確了clAP2蛋白可以下調(diào)HBV多聚酶蛋白水平的現(xiàn)象,并進(jìn)一步探討了其可能機(jī)制；通過(guò)clAP2各截短體質(zhì)粒與多聚酶瞬時(shí)共轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)clAP2的BIR2和RING結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄浒l(fā)揮降解作用尤為重要；且clAP2與HBV多聚酶存在相互作用,主要由BIR2和BIR3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)；此外,clAP2可以介導(dǎo)泛素分子連接到HBV多聚酶的N末端氨基酸殘基上導(dǎo)致多聚酶泛素化并將其降解。上述研究部分揭示了體內(nèi)泛素相關(guān)蛋白clAP2下調(diào)HBV多聚酶蛋白水平的機(jī)制,并可為臨床治療乙型肝炎和尋找潛在的藥物靶點(diǎn)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Hepatitis B virus (HBV) is a pathogen that is seriously harmful to human health, and its greatest harm is that chronic persistent infection of HBV is easy to develop into liver cirrhosis or liver cancer. Currently, the drugs for treating HBV are mainly interferon (IFN), nuclear antigen analogs (lamivudine lamivudine, etc.) and immunomodulators, but these methods can only reduce the virus copy number in the body, and can not finally clear the hepatitis B virus in the body. It has been shown that tumor necrosis factor-1 (TNF-1) can inhibit the replication of HBV by non-killing mechanism, and the possible mechanism is the activation of the NF-K B pathway by TNF-antigen, which in turn affects the package of virus core particles. In this paper, Dr. Liu Xiaoying, in this room, was used to screen the gene expression profile of HepG2 cells treated with TNF, and it was found that the expression of the protein 2 could be significantly induced, and that the expression of the protein could inhibit the replication of HBV. Further, it was found that cIAP2 could downregulate the HBV RNA water. In view of the fact that the clAP2 protein is an E3 ligase, the protein degradation can be mediated, so the expression clAP2 ( ?) The plasmid of each of the HBV-encoding proteins is co-transfected into the cell, and it is found that the clAP2 can specifically down-regulate the water of the HBV polymerase. On the basis of this, it is proposed to further clarify its molecular machine System. First, the expression method was used to confirm that the expression of clAP2 in the liver cell system could significantly reduce the HBV polymerase. And the level of the endogenous clAP2 protein in the Huh7 and Hela cells is further detected by using the RNA interference technique, and the level of the HBV multimer can be obtained. In view of the fact that the clAP2 protein is composed of the BIR domain, the CARD domain and the RING domain, a truncated mutant of each domain of the clAP2 protein is constructed in the study to understand the domain of the clAP2 down-regulation of the level of the polyenzyme protein, and the truncated mutant of the clAP2 protein is co-rotated with the HBV polymerase expression plasmid. The results of the experiment show that the BIR2 and RING domains of the clAP2 protein are down-regulated in the cells. Due to the fact that the C-terminal RING domain of the clAP2 protein has the activity of E3 ligase, the degradation of the substrate caused by the specific substrate ubiquitination can be promoted, the deletion mutant plasmid of the clAP2 E3 function is further constructed, and the mutant plasmid is co-transfected with the HBV polymerase into the H uh7 cells, it was found that this mutant could not down-regulate the level of the expression of the polyenzyme, suggesting that the clAP2 down-regulate the level of the multimer expression and its RING domain E3 connection The enzyme activity is related. clAP2 should be used as the E3 ligase of the HBV polymerase. In order to confirm this, a clAP2 containing the GST-labeled protein and each of the truncated constitutional particles was constructed and expressed in a prokaryote. The results of the GST-pull down show that the clAP2 and the HBV polymerase have a direct interaction in vitro, and this interaction is mediated by BIR2 and BI of clAP2. At the same time, the fluorescent test suggested that the HBV polyenzyme was mainly located in the cytoplasm of the cell, and it was closely related to the clAP2 protein. in order to detect whether the clAP2 can be used as E3 ligase to mediate the ubiquitin molecule to be linked to the HBV polymerase and lead to the degradation of the ubiquitin, the in vivo ubiquitination experiment is further adopted, and the result proves that the clAP2 can promote the HBV The ubiquitination of the polyase is enhanced. It is known that the ubiquitin molecule is usually linked to the substrate in two modes: via a lysine site inside the substrate The results of this research show that the instability of the HBV polymerase is mainly mediated by its TP and RH domains. In this study, the lysine sites on the TP and RH domains were first mutated to arginine, and the results showed that the modified polyenzyme It can still be degraded by clAP2, suggesting that the clAP2-mediated ubiquitin molecule may not be linked to the HBV polymerase. The further study shows that the macromolecular tag attached to the N-terminal of the HBV polymerase can stabilize the protein and indicate the instability of the HBV polymerase. In conclusion, by transient transfection and RNA interference, it is clear that the clAP2 protein can downregulate the level of HBV polymerase protein. It was found that the biR2 and RING domains of clAP2 play a very important role in the degradation of the biR2 and the RING domains of clAP2, and the interaction of clAP2 with the HBV polymerase is mainly caused by BIR2. And the clAP2 can mediate the binding of the ubiquitin molecule to the N-terminal amino acid residue of the HBV polymerase. The above-mentioned research part reveals the mechanism of down-regulation of the level of HBV polymerase protein by the ubiquitin-related protein clAP2, and can be used for clinical treatment of hepatitis B and for searching for potential medicine.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R373.21

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本文編號(hào)：2504487