【摘要】： 目的: 1.了解心肌條件培養(yǎng)液有無(wú)誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞(Cardiac stem cells,CSCs)向心肌細(xì)胞分化的作用。 2.CSCs與心肌細(xì)胞接觸對(duì)CSCs分化有何影響。 方法: 1.將新生1-2天小鼠心臟組織剪成0.5-1mm3碎片,用DPBS洗滌紅細(xì)胞,輕微消化組織塊后,進(jìn)行貼壁培養(yǎng)11-14天后,用胰酶進(jìn)行差速消化并采集原代CSCs。 2.用免疫磁珠分選原代細(xì)胞得到c-Kit+ CSCs。 3.流式細(xì)胞術(shù)分析未分選的原代細(xì)胞表面CD45、CD34、Sca-1、c-Kit標(biāo)志。分選后細(xì)胞檢測(cè)c-Kit標(biāo)志純度及細(xì)胞周期。 4.結(jié)合原位免疫熒光檢驗(yàn)c-Kit+的純度。 5.分選后的c-Kit+ CSCs分3組進(jìn)行培養(yǎng)。 a.空白對(duì)照組,無(wú)干預(yù)因素,用1%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)CSCs 21天。 b.條件液組添加心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)CSCs 21天。用1%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞48小時(shí)后得到心肌條件培養(yǎng)液。方法示意圖見附圖尾頁(yè)。 c.混合培養(yǎng)組分別用PKH26和DAPI標(biāo)記CSCs后與心肌細(xì)胞混合共培養(yǎng)8天,期間均以1%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。 PKH26標(biāo)記的CSCs用于免疫組化鑒定,并與空白組和條件液進(jìn)行對(duì)比; DAPI標(biāo)記的CSCs,共培養(yǎng)后再進(jìn)行消化分離并分散傳代,改用10%血清培養(yǎng)液,2周內(nèi),觀察并尋找來(lái)源于CSCs,帶DAPI標(biāo)記的單獨(dú)搏動(dòng)細(xì)胞。 6.觀察各組CSCs形態(tài)變化,當(dāng)空白組、條件液組和PKH26標(biāo)記的混合培養(yǎng)組的細(xì)胞完成培養(yǎng)后,用原位免疫組化法鑒定肌鈣蛋白T(Troponin-T)和間隙連接蛋白43(connexin43),評(píng)估CSCs向心肌細(xì)胞分化的程度,每組檢測(cè)一種蛋白需要6個(gè)培養(yǎng)樣本,其中1個(gè)用于陰性對(duì)照。 7.分析試驗(yàn)數(shù)據(jù):原位免疫組化每孔隨機(jī)抽四周+中央五個(gè)200倍視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞后進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)分析,以P0.05為差異具有顯著性。混合培養(yǎng)組中評(píng)估在心肌細(xì)胞附近的CSCs。 結(jié)果: 1.原代未分選的細(xì)胞主要表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志c-Kit和Sca-1,低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和白細(xì)胞標(biāo)志CD45。 2.分選后得到純度較高的c-Kit+ CSCs,流式細(xì)胞術(shù)分析其純度約96%,原位免疫熒光檢驗(yàn)也支持以上結(jié)果。 3.分選后的c-Kit+ CSCs中處于S期和G2期的細(xì)胞比例約34.6%,說(shuō)明其染色體復(fù)制和細(xì)胞分裂較活躍。 4.空白組CSCs在低血清條件下增殖活力較差,部分細(xì)胞死亡;條件液組中CSCs增殖活力稍好,細(xì)胞平均密度是空白組的2倍�？瞻捉M和條件液組均未出現(xiàn)自發(fā)搏動(dòng)的細(xì)胞�；旌吓囵B(yǎng)組中與心肌細(xì)胞接觸的CSCs形態(tài)飽滿,并與心肌細(xì)胞同步搏動(dòng)。分離混合培養(yǎng)的細(xì)胞,可見少數(shù)單獨(dú)搏動(dòng)的帶DAPI標(biāo)記的細(xì)胞。 5.原位免疫組化技術(shù):經(jīng)過(guò)21天后,心肌條件培養(yǎng)液不能有效的誘導(dǎo)CSCs分化成熟至表達(dá)心肌細(xì)胞特異的Troponin-T和connexin43蛋白,條件液組與空白組比較無(wú)顯著性差異。而CSCs與心肌細(xì)胞接觸8天后,能表達(dá)上述兩種蛋白,與空白組比較有顯著性差異。 結(jié)論 1.心肌條件培養(yǎng)液無(wú)誘導(dǎo)CSCs向心肌細(xì)胞分化的作用。 2.與心肌細(xì)胞接觸能有效地誘導(dǎo)CSCs向心肌分化。
[Abstract]:Purpose: 1. To understand the presence or absence of myocardial conditioned medium in the differentiation of cardiac muscle cells the effect of CSCs and the contact of the cardiac muscle cells to the CSC s differentiation Methods:1.1-2 day mouse heart tissue was cut into 0.5-1 mm3 fragment, red blood cells were washed with DPBS, and after the tissue mass was slightly digested, the wall was cultured for 11-14 days, and the pancreatic enzymes were used. the differential digestion is carried out and the primary CSCs are collected;2. the primary CSCs are used The primary cells were sorted by beads to obtain c-Kit + CSCs.3. Flow cytometry was used to analyze the surface of unsorted primary cells. CD45,CD34,Sca-1,c-Kit鏍，

本文編號(hào)：2502876