【摘要】： 目的 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一種定植于支氣管擴張、肺囊性纖維化和慢性阻塞性肺病病人下呼吸道的機會致病菌,可持續(xù)刺激宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致進展性的氣道破壞,具有多重耐藥的特點,一旦感染,臨床治療十分困難。研究發(fā)現(xiàn),PA可分泌多種毒力因子,導(dǎo)致機體發(fā)病。其中大部分PA分泌一種藍綠色的色素毒素即綠膿菌素(Pyocyanin,PCN),存在于CF病人痰液中,能夠促進炎癥反應(yīng),干擾呼吸道纖毛功能,在急性侵襲性感染中起重要作用。但其作用機制尚不明確,因此探討PA及PCN感染宿主的發(fā)病機制至關(guān)重要。 肺泡巨噬細胞是重要的防御細胞及炎癥調(diào)控細胞,可通過活化NF-κB而啟動大量炎癥介質(zhì)、細胞因子等合成介導(dǎo)急性肺損傷。而人髓系白血病細胞系-U937細胞具有單核母細胞和未成熟單核細胞的特征,可被佛波酯(PMA)誘導(dǎo)分化形成單核/巨噬細胞,因此,U937細胞是研究人單核/巨噬細胞分化的較理想模型。PA感染的顯著特征是大量中性粒細胞(PMN)s在呼吸道表面聚集,發(fā)生嚴重的炎癥反應(yīng)。IL-6、IL-1β及IL-8為重要的促炎細胞因子和PMNs趨化因子,IL-8釋放增加是導(dǎo)致感染肺部PMNs增多最主要的原因。研究表明,PA可分泌多種毒力因子誘導(dǎo)呼吸道上皮細胞及單核細胞釋放促炎細胞因子,然而PA活菌及其毒力因子綠膿菌素的體外研究大多集中在氣道上皮細胞及中性粒細胞,較少有PCN誘導(dǎo)單核細胞的報告。至于PA活菌及綠膿菌素能否誘導(dǎo)U937細胞產(chǎn)生細胞因子IL-8、IL-6等,細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑如何?至今仍不清楚。IL-1β是宿主防御病原菌感染機制中起重要作用的前炎癥細胞因子,體內(nèi)研究表明內(nèi)源性IL-1活性的減少或消失能抑制炎癥反應(yīng)進而抵抗PA引起的肺炎,提示IL-1β可能參與PA的發(fā)病機制,然而IL-1β在U937細胞抗PA免疫反應(yīng)中作用如何?目前尚不明確。 因此本研究探討PA對U937細胞IL-8及IL-6表達的誘導(dǎo)作用及綠膿菌素對IL-8表達的影響及其胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路,并探討IL-1β在U937細胞抗PA免疫反應(yīng)中的作用。在此基礎(chǔ)上,進一步探討NF-κB及其誘導(dǎo)的細胞因子在PA感染鼠肺中的表達及二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)對其表達的影響,從而為臨床治療提供良好的理論依據(jù)。 方法 實驗分體外和體內(nèi)兩部分進行,以U937細胞作為體外細胞模型,SD大鼠作為體內(nèi)模型進行實驗。 1、體外部分 (1)PA采用標準菌株ATCC27853。通過光分解法從吩嗪N-甲硫酸鹽(PMS)中提取PCN,并用反相高效液相色譜儀(HPLC)進一步純化,獲取純化的PCN。 (2)分別用不同濃度的PA活菌{multiplicity of infections(MOI)of PA:U937cells為10:1,20:1及50:1}感染U937細胞或PMA分化的U937細胞,PA感染細胞2h后,收集細胞,提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR法檢測細胞IL-8及IL-6mRNA表達。于8、16及24h收集細胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-8及IL-6的濃度變化。 (3)應(yīng)用免疫印記方法檢測PA感染U937細胞后NF-κB及I-κB蛋白變化。分別于PA感染前60min以不同濃度的PKC活化抑制劑鈣感光蛋白(Cal.C)和NF-κB活化抑制劑PDTC預(yù)處理,然后以PA感染U937細胞60min(PA:U937為20:1),收集細胞蛋白,進行細胞漿和核蛋白的提取,蛋白定量,免疫印記,并觀察PKC和NF-κB活化抑制劑對其表達的影響。 (4)應(yīng)用免疫細胞化學(xué)方法觀察PA刺激U937細胞后NF-κBp65的蛋白表達。 (5)分別用不同濃度的綠膿菌素(5、25、50μM)感染PMA分化的U937細胞,于24h收集細胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-8的濃度變化。綠膿菌素分別感染細胞1h、2h,收集細胞,提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR法檢測細胞IL-8mRNA表達。 (6)應(yīng)用Western blotting方法觀察綠膿菌素(50μM)刺激U937細胞胞內(nèi)MAPK(p38MAPK和ERK1/2)通路信號分子的動態(tài)變化以及NF-κB的蛋白表達,并通過RT-PCR和ELISA方法觀察MAPKs抑制劑PD98059和SB203580以及NF-κ3活化抑制劑PDTC對IL-8表達的影響,進一步證實MAPKs及NF-κB信號傳導(dǎo)通路是否參與了綠膿菌素誘導(dǎo)U937細胞IL-8的表達。 (7)作為陽性對照,IL-1β或TNF-α單獨或與綠膿菌素聯(lián)合作用U937細胞,于2h收集細胞,提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR法檢測細胞IL-8 mRNA表達,觀察IL-1β或TNF-α與綠膿菌素在刺激U937細胞表達IL-8方面是否具有協(xié)同作用。IL-1β與PA聯(lián)合作用U937細胞,24h后收集培養(yǎng)上清,于ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-8的濃度變化,觀察IL-1β在PA感染中的作用。 2、體內(nèi)部分 隨機將72只雄性SD大鼠分為對照組、PA組和PDTC組,每組24只。于對照組和PA組大鼠腹腔分別注射1ml生理鹽水,PDTC組大鼠腹腔注射等容積的PDTC200mg.kg~(-1)。乙醚麻醉大鼠,對照組氣管內(nèi)接種磷酸鹽緩沖液(PBS)0.2ml,PA組和PDTC組分別接種PA懸液0.2ml(6×10~8CFU/ml)。按PA刺激后不同時間又分為3、6、16、24h亞組,每亞組6只大鼠。觀察大鼠一般狀態(tài)、肺組織形態(tài)學(xué)改變、免疫組織化學(xué)染色及Western blotting檢測肺組織NF-κBp65的蛋白表達、ELISA法檢測BALF中IL-8的含量。 結(jié)果 1、體外部分 (1)PA可促進PMA分化的U937細胞IL-8及IL-6mRNA表達和蛋白分泌,而且具有明顯的量效和時效關(guān)系。 (2)重組IL-1β可增強PA誘導(dǎo)PMA分化的U937細胞產(chǎn)生IL-8。 (3)PA能直接誘導(dǎo)并迅速活化NF-κB,于PA感染后60min I-κB磷酸化、NF-κB活化明顯,PKC阻斷劑Cal C及NF-κB阻斷劑PDTC均能顯著抑制NF-κB的活化。 (4)PKC阻斷劑Cal C及NF-κB阻斷劑PDTC均能以濃度依賴的方式抑制IL-8及IL-6的分泌。 (5)免疫細胞化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示:正常時,NF-κBp65蛋白在胞漿均勻分布,胞漿內(nèi)呈棕色均勻淡染,PA刺激后1h,NF-κBp65被激活轉(zhuǎn)入核內(nèi),染色以核明顯,給予Cal C和PDTC預(yù)處理1h后再給予PA刺激,NF-κBp65重新分布于胞漿,胞核也有一定分布。 (6)綠膿菌素可促進PMA分化的U937細胞IL-8mRNA的表達及IL-8的分泌,而且具有明顯的量效和時效關(guān)系。 (7)P38MAPK在加入綠膿菌素后10min表達明顯增高,30min達高峰,然后逐漸降低。而10min和30min組分別加入抑制劑SB203580,P38MAPK表達明顯被抑制,僅可見少量表達,而總的P38MAPK水平在整個實驗期間內(nèi)無變化。 (8)ERK1/2在加入綠膿菌素后10min表達明顯增高,30min達高峰,然后逐漸降低。而10min和30min組分別加入抑制劑PD98059,ERK1/2表達明顯被抑制,而總的ERK水平在整個實驗期間內(nèi)無變化。 (9)NF-κB p65的蛋白表達于綠膿菌素感染后30min明顯表達,60min表達最為明顯。 (10)分別用SB203580抑制P38MAPK通路、用PD98059抑制ERK通路、用PDTC抑制NF-κB p65通路,均能引起抑制劑濃度依賴的IL-8蛋白分泌降低。 (11)綠膿菌素與TNF-α或IL-1β單獨均能誘導(dǎo)U937細胞表達IL-8,但綠膿菌素與其分別聯(lián)合未發(fā)現(xiàn)具有協(xié)同作用。 2、體內(nèi)部分 (1)體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn),PA組大鼠肺組織明顯充血、水腫,大量炎性細胞浸潤,PDTC預(yù)處理組炎性細胞浸潤明顯減輕。 (2)免疫組化顯示3～24h可見NF-κB陽性細胞表達,以3h明顯增多。Westernblotting結(jié)果顯示PA組NF-κB的表達于3 h達高峰。PDTC預(yù)處理組較PA組NF-κB表達明顯減少(P＜0.01)。 (3)IL-8的蛋白分泌于3-24h均增高,IL-8的蛋白分泌量于16h達高峰。PDTC預(yù)處理組較PA組明顯減少(P＜0.01)。 結(jié)論 1、PA可能通過PKC信號通路促進NF-κB的活化,從而啟動IL-8及IL-6的高效表達和分泌,加重炎癥反應(yīng),IL-1β可能在PA炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中起著重要的調(diào)節(jié)作用,此項研究可能為預(yù)防和控制PA引起機體炎癥反應(yīng)和炎癥損傷提供新的思路。 2、綠膿菌素與TNF-α或IL-1β單獨均能誘導(dǎo)U937細胞表達IL-8。綠膿菌素以濃度和時間依賴的方式感染U937細胞促進IL-8的分泌和mRNA表達,表明綠膿菌素在PA感染中具有重要的致炎作用。MAPKs及NF-κB信號傳導(dǎo)通路可能參與綠膿菌素感染U937細胞IL-8的表達。 3、NF-κB及其誘導(dǎo)的促炎介質(zhì)在PA肺炎中發(fā)揮重要作用,PDTC可能通過抑制NF-κB的活性減輕PA引起的肺損傷。
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【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R378.9

【引證文獻】

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1 李冬麗;王士剛;;老年肺部感染所致病原菌同細胞因子白細胞介素-17的關(guān)系[J];中國老年學(xué)雜志;2012年22期

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本文編號：2501813