【摘要】： 目的 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一種定植于支氣管擴(kuò)張、肺囊性纖維化和慢性阻塞性肺病病人下呼吸道的機(jī)會(huì)致病菌,可持續(xù)刺激宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致進(jìn)展性的氣道破壞,具有多重耐藥的特點(diǎn),一旦感染,臨床治療十分困難。研究發(fā)現(xiàn),PA可分泌多種毒力因子,導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病。其中大部分PA分泌一種藍(lán)綠色的色素毒素即綠膿菌素(Pyocyanin,PCN),存在于CF病人痰液中,能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng),干擾呼吸道纖毛功能,在急性侵襲性感染中起重要作用。但其作用機(jī)制尚不明確,因此探討PA及PCN感染宿主的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。 肺泡巨噬細(xì)胞是重要的防御細(xì)胞及炎癥調(diào)控細(xì)胞,可通過(guò)活化NF-κB而啟動(dòng)大量炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等合成介導(dǎo)急性肺損傷。而人髓系白血病細(xì)胞系-U937細(xì)胞具有單核母細(xì)胞和未成熟單核細(xì)胞的特征,可被佛波酯(PMA)誘導(dǎo)分化形成單核/巨噬細(xì)胞,因此,U937細(xì)胞是研究人單核/巨噬細(xì)胞分化的較理想模型。PA感染的顯著特征是大量中性粒細(xì)胞(PMN)s在呼吸道表面聚集,發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。IL-6、IL-1β及IL-8為重要的促炎細(xì)胞因子和PMNs趨化因子,IL-8釋放增加是導(dǎo)致感染肺部PMNs增多最主要的原因。研究表明,PA可分泌多種毒力因子誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞及單核細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子,然而PA活菌及其毒力因子綠膿菌素的體外研究大多集中在氣道上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞,較少有PCN誘導(dǎo)單核細(xì)胞的報(bào)告。至于PA活菌及綠膿菌素能否誘導(dǎo)U937細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-8、IL-6等,細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑如何?至今仍不清楚。IL-1β是宿主防御病原菌感染機(jī)制中起重要作用的前炎癥細(xì)胞因子,體內(nèi)研究表明內(nèi)源性IL-1活性的減少或消失能抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而抵抗PA引起的肺炎,提示IL-1β可能參與PA的發(fā)病機(jī)制,然而IL-1β在U937細(xì)胞抗PA免疫反應(yīng)中作用如何?目前尚不明確。 因此本研究探討PA對(duì)U937細(xì)胞IL-8及IL-6表達(dá)的誘導(dǎo)作用及綠膿菌素對(duì)IL-8表達(dá)的影響及其胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路,并探討IL-1β在U937細(xì)胞抗PA免疫反應(yīng)中的作用。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討NF-κB及其誘導(dǎo)的細(xì)胞因子在PA感染鼠肺中的表達(dá)及二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)對(duì)其表達(dá)的影響,從而為臨床治療提供良好的理論依據(jù)。 方法 實(shí)驗(yàn)分體外和體內(nèi)兩部分進(jìn)行,以U937細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型,SD大鼠作為體內(nèi)模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 1、體外部分 (1)PA采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853。通過(guò)光分解法從吩嗪N-甲硫酸鹽(PMS)中提取PCN,并用反相高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)一步純化,獲取純化的PCN。 (2)分別用不同濃度的PA活菌{multiplicity of infections(MOI)of PA:U937cells為10:1,20:1及50:1}感染U937細(xì)胞或PMA分化的U937細(xì)胞,PA感染細(xì)胞2h后,收集細(xì)胞,提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞IL-8及IL-6mRNA表達(dá)。于8、16及24h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8及IL-6的濃度變化。 (3)應(yīng)用免疫印記方法檢測(cè)PA感染U937細(xì)胞后NF-κB及I-κB蛋白變化。分別于PA感染前60min以不同濃度的PKC活化抑制劑鈣感光蛋白(Cal.C)和NF-κB活化抑制劑PDTC預(yù)處理,然后以PA感染U937細(xì)胞60min(PA:U937為20:1),收集細(xì)胞蛋白,進(jìn)行細(xì)胞漿和核蛋白的提取,蛋白定量,免疫印記,并觀察PKC和NF-κB活化抑制劑對(duì)其表達(dá)的影響。 (4)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察PA刺激U937細(xì)胞后NF-κBp65的蛋白表達(dá)。 (5)分別用不同濃度的綠膿菌素(5、25、50μM)感染PMA分化的U937細(xì)胞,于24h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8的濃度變化。綠膿菌素分別感染細(xì)胞1h、2h,收集細(xì)胞,提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞IL-8mRNA表達(dá)。 (6)應(yīng)用Western blotting方法觀察綠膿菌素(50μM)刺激U937細(xì)胞胞內(nèi)MAPK(p38MAPK和ERK1/2)通路信號(hào)分子的動(dòng)態(tài)變化以及NF-κB的蛋白表達(dá),并通過(guò)RT-PCR和ELISA方法觀察MAPKs抑制劑PD98059和SB203580以及NF-κ3活化抑制劑PDTC對(duì)IL-8表達(dá)的影響,進(jìn)一步證實(shí)MAPKs及NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路是否參與了綠膿菌素誘導(dǎo)U937細(xì)胞IL-8的表達(dá)。 (7)作為陽(yáng)性對(duì)照,IL-1β或TNF-α單獨(dú)或與綠膿菌素聯(lián)合作用U937細(xì)胞,于2h收集細(xì)胞,提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá),觀察IL-1β或TNF-α與綠膿菌素在刺激U937細(xì)胞表達(dá)IL-8方面是否具有協(xié)同作用。IL-1β與PA聯(lián)合作用U937細(xì)胞,24h后收集培養(yǎng)上清,于ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8的濃度變化,觀察IL-1β在PA感染中的作用。 2、體內(nèi)部分 隨機(jī)將72只雄性SD大鼠分為對(duì)照組、PA組和PDTC組,每組24只。于對(duì)照組和PA組大鼠腹腔分別注射1ml生理鹽水,PDTC組大鼠腹腔注射等容積的PDTC200mg.kg~(-1)。乙醚麻醉大鼠,對(duì)照組氣管內(nèi)接種磷酸鹽緩沖液(PBS)0.2ml,PA組和PDTC組分別接種PA懸液0.2ml(6×10~8CFU/ml)。按PA刺激后不同時(shí)間又分為3、6、16、24h亞組,每亞組6只大鼠。觀察大鼠一般狀態(tài)、肺組織形態(tài)學(xué)改變、免疫組織化學(xué)染色及Western blotting檢測(cè)肺組織NF-κBp65的蛋白表達(dá)、ELISA法檢測(cè)BALF中IL-8的含量。 結(jié)果 1、體外部分 (1)PA可促進(jìn)PMA分化的U937細(xì)胞IL-8及IL-6mRNA表達(dá)和蛋白分泌,而且具有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。 (2)重組IL-1β可增強(qiáng)PA誘導(dǎo)PMA分化的U937細(xì)胞產(chǎn)生IL-8。 (3)PA能直接誘導(dǎo)并迅速活化NF-κB,于PA感染后60min I-κB磷酸化、NF-κB活化明顯,PKC阻斷劑Cal C及NF-κB阻斷劑PDTC均能顯著抑制NF-κB的活化。 (4)PKC阻斷劑Cal C及NF-κB阻斷劑PDTC均能以濃度依賴的方式抑制IL-8及IL-6的分泌。 (5)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示:正常時(shí),NF-κBp65蛋白在胞漿均勻分布,胞漿內(nèi)呈棕色均勻淡染,PA刺激后1h,NF-κBp65被激活轉(zhuǎn)入核內(nèi),染色以核明顯,給予Cal C和PDTC預(yù)處理1h后再給予PA刺激,NF-κBp65重新分布于胞漿,胞核也有一定分布。 (6)綠膿菌素可促進(jìn)PMA分化的U937細(xì)胞IL-8mRNA的表達(dá)及IL-8的分泌,而且具有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。 (7)P38MAPK在加入綠膿菌素后10min表達(dá)明顯增高,30min達(dá)高峰,然后逐漸降低。而10min和30min組分別加入抑制劑SB203580,P38MAPK表達(dá)明顯被抑制,僅可見(jiàn)少量表達(dá),而總的P38MAPK水平在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)無(wú)變化。 (8)ERK1/2在加入綠膿菌素后10min表達(dá)明顯增高,30min達(dá)高峰,然后逐漸降低。而10min和30min組分別加入抑制劑PD98059,ERK1/2表達(dá)明顯被抑制,而總的ERK水平在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)無(wú)變化。 (9)NF-κB p65的蛋白表達(dá)于綠膿菌素感染后30min明顯表達(dá),60min表達(dá)最為明顯。 (10)分別用SB203580抑制P38MAPK通路、用PD98059抑制ERK通路、用PDTC抑制NF-κB p65通路,均能引起抑制劑濃度依賴的IL-8蛋白分泌降低。 (11)綠膿菌素與TNF-α或IL-1β單獨(dú)均能誘導(dǎo)U937細(xì)胞表達(dá)IL-8,但綠膿菌素與其分別聯(lián)合未發(fā)現(xiàn)具有協(xié)同作用。 2、體內(nèi)部分 (1)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PA組大鼠肺組織明顯充血、水腫,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),PDTC預(yù)處理組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。 (2)免疫組化顯示3～24h可見(jiàn)NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),以3h明顯增多。Westernblotting結(jié)果顯示PA組NF-κB的表達(dá)于3 h達(dá)高峰。PDTC預(yù)處理組較PA組NF-κB表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。 (3)IL-8的蛋白分泌于3-24h均增高,IL-8的蛋白分泌量于16h達(dá)高峰。PDTC預(yù)處理組較PA組明顯減少(P＜0.01)。 結(jié)論 1、PA可能通過(guò)PKC信號(hào)通路促進(jìn)NF-κB的活化,從而啟動(dòng)IL-8及IL-6的高效表達(dá)和分泌,加重炎癥反應(yīng),IL-1β可能在PA炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中起著重要的調(diào)節(jié)作用,此項(xiàng)研究可能為預(yù)防和控制PA引起機(jī)體炎癥反應(yīng)和炎癥損傷提供新的思路。 2、綠膿菌素與TNF-α或IL-1β單獨(dú)均能誘導(dǎo)U937細(xì)胞表達(dá)IL-8。綠膿菌素以濃度和時(shí)間依賴的方式感染U937細(xì)胞促進(jìn)IL-8的分泌和mRNA表達(dá),表明綠膿菌素在PA感染中具有重要的致炎作用。MAPKs及NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路可能參與綠膿菌素感染U937細(xì)胞IL-8的表達(dá)。 3、NF-κB及其誘導(dǎo)的促炎介質(zhì)在PA肺炎中發(fā)揮重要作用,PDTC可能通過(guò)抑制NF-κB的活性減輕PA引起的肺損傷。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R378.9

【引證文獻(xiàn)】

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1 李冬麗;王士剛;;老年肺部感染所致病原菌同細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17的關(guān)系[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2012年22期

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本文編號(hào)：2501813