【摘要】： 目的:腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)作為神經(jīng)營養(yǎng)因(neurotrophic factors NTF)家族的第二成員,是一種主要由腦組織合成、能夠維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種神經(jīng)元存活及促進(jìn)神經(jīng)軸突生長的堿性蛋白。BDNF基因在正常的大鼠脊髓中也有少量表達(dá),當(dāng)脊髓受損傷后局部的組織細(xì)胞表達(dá)BDNF升高,可以促進(jìn)脊髓神經(jīng)元功能恢復(fù),但表達(dá)量不穩(wěn)定,時間較短。應(yīng)用復(fù)制缺陷型重組腺病毒(Adenovirus AdV)為載體導(dǎo)入神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因治療,已成為神經(jīng)修復(fù)研究領(lǐng)域研究重點課題。但神經(jīng)營養(yǎng)因子導(dǎo)入后機(jī)體往往將其看做為異體抗原引發(fā)免疫反應(yīng),成為應(yīng)用神經(jīng)因子基因治療的影響因素之一。本實驗將攜帶BDNF基因的AdV (AdBDNF)與不帶外源基因的Ad0或與攜帶細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4immunoglobulin,CTLA4Ig )基因的AdV (AdCTLA4Ig)兩種腺病毒混懸液通過微量注射導(dǎo)入大鼠腰膨大脊髓實質(zhì)內(nèi),比較兩組BDNF基因在脊髓前角表達(dá)的情況,以探討腺病毒介導(dǎo)的CTLA4Ig基因?qū)餐瑢?dǎo)入的BDNF基因表達(dá)的影響。 方法:選用7周齡健康Wistar大鼠98只,體重200-250g。將大鼠隨機(jī)分成三組:正常對照組(A組)為正常大鼠,不導(dǎo)入腺病毒;實驗對照組(B組)導(dǎo)入Ad0+AdBDNF;實驗組(C組)導(dǎo)入AdCTLA4Ig +AdBDNF。將實驗對照組及實驗組大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于腦立體定位儀上。取長約2cm后正中切口,去除T13椎板,暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手動推進(jìn)器,于脊髓后正中動脈右側(cè)0.8mm處注射Ad0(5×109pfu/ml)與AdBDNF(1×109 pfu/ml)的混懸液2μl(B組)或AdBDNF(1×109 pfu/ml)與AdCTLA4Ig(1×109 pfu/ml) 2μl(C組)。針尖向頭側(cè)呈45度斜行進(jìn)針,斜行刺入深度為2.5mm。注射速度為1μl/min,注射完畢后滯針5min,緩慢拔針。充分止血、沖洗傷口,局部噴灑抗生素預(yù)防感染,關(guān)閉傷口。B、C組大鼠轉(zhuǎn)染病毒后2天、4天、7天、15天、30天、45天、60天取材,標(biāo)本為大鼠脊髓。對三組大鼠脊髓進(jìn)行厚40μm的連續(xù)冰凍橫切片經(jīng)行免疫組織化學(xué)染色,計數(shù)三組中不同時間點BDNF在脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元染色陽性的細(xì)胞計數(shù)及BDNF免疫陽性產(chǎn)物積分光密度值(IOD)測定,采用免疫熒光染色檢測AdCTLA4Ig持續(xù)表達(dá)時間并采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)監(jiān)測B、C兩組病毒注入脊髓的存活時間,及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測三組BDNF基因在大鼠脊髓中表達(dá)的情況。 結(jié)果: 1 BDNF, CTLA4Ig的轉(zhuǎn)基因表達(dá) 1.1 CTLA4Ig轉(zhuǎn)基因表達(dá):實驗組術(shù)后兩天可見到免疫陽性細(xì)胞,可持續(xù)到術(shù)后45天隨時間推移于術(shù)后60天無免疫陽性細(xì)胞出現(xiàn)。 1.2 BDNF轉(zhuǎn)基因表達(dá):在正常對照組(A組),大鼠脊髓的腹角運(yùn)動神動元和脊髓后角感覺神經(jīng)元及部分膠質(zhì)細(xì)胞中可見少量BDNF陽性細(xì)胞,其陽性產(chǎn)物亞細(xì)胞定位主要分布于細(xì)胞漿。實驗對照組及實驗組陽性細(xì)胞多存在于注射側(cè)的脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元和周圍的膠質(zhì)細(xì)胞。實驗對照組(B組)導(dǎo)入Ad0+AdBDNF后BDNF陽性染色細(xì)胞數(shù)及免疫陽性產(chǎn)物的積分光密度值(IOD)明顯增加并于術(shù)后7天達(dá)到高峰隨時間推移30天時表達(dá)量已接近正常對照組,實驗組(C組)導(dǎo)入CTLA4Ig+AdBDNF后BDNF陽性染色細(xì)胞數(shù)及免疫陽性產(chǎn)物的積分光密度值(IOD)明顯增加并同樣于術(shù)后7天達(dá)到高峰且表達(dá)量高于正常組(A組)及實驗組(B組)但高峰持續(xù)時間明顯延長于60天時表達(dá)量同正常組(A組)及實驗組(B組)無明顯差異。統(tǒng)計學(xué)分析表明:三組BDNF陽性染色細(xì)胞數(shù)及免疫陽性產(chǎn)物的積分光密度值(IOD)在4天、7天、15天、30天、45天均存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),BDNF陽性染色細(xì)胞數(shù)及免疫陽性產(chǎn)物積的分光密度值(IOD)在2天及60天三組之間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 2 PCR檢測: 2.1腺病毒液PCR檢測:腺病毒的表達(dá)量隨著濃度的降低而逐漸減小。采用病毒液10倍系列稀釋提取后DNA經(jīng)PCR反應(yīng)可檢測出腺病毒的特異性條帶的最低稀釋度為10-4,AdlacZ(1×109pfu/ml)與Ad0(5×109 pfu/ml)特異性條帶的最低稀釋度一致。 2.2脊髓標(biāo)本腺病毒PCR的檢測:用PCR法從DNA水平分別檢測腺病毒在實驗對照組、實驗組的脊髓標(biāo)本中存活時間。腺病毒的DNA量是隨時間延長逐漸下降的,實驗對照組(B)組至45天而實驗組至第60天均檢測不到腺病毒的表達(dá)。 3 RT-PCR檢測: 3.1 BDNFmRNA在大鼠脊髓組織的表達(dá):用RT-PCR法從mRNA水平分別檢測BDNF在對照組、實驗對照、實驗組的表達(dá)情況:轉(zhuǎn)染2天后三組均可檢測出BDNFmRNA在大鼠脊髓組織的表達(dá),實驗對照組及實驗組表達(dá)上調(diào)高峰均為術(shù)后7天,實驗組及實驗對照組高表達(dá)量可以持續(xù)30天及15天,對照組到第45天完全消失。實驗組到第60天完全消失。統(tǒng)計學(xué)分析表明兩組之間在高峰期間BDNFmRNA表達(dá)量有顯著差異(P0.05),組內(nèi)不同時間點比較BDNFmRNA表達(dá)量有顯著差(P0.05)。 3.2 CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓組織的表達(dá):用RT-PCR法從mRNA水平分別檢測CTLA4IgmRNA在實驗組的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染2天后實驗組可檢測出CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓組織的表達(dá),表達(dá)上調(diào)高峰為術(shù)后4-7天,高表達(dá)量可以持續(xù)到2周,到第45天完全消失。 結(jié)論:在正常Wistar大鼠脊髓中,有少量的BDNF染色陽性細(xì)胞及微量的BDNFmRNA表達(dá)。實驗組將AdV介導(dǎo)的CTLA4Ig基因注射入脊髓能有效地抑制局部T淋巴細(xì)胞的浸潤,從而減輕由AdV介導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng),抑制機(jī)體對病毒載體的排斥反應(yīng),顯著延長共同導(dǎo)入的BDNF基因在脊髓的表達(dá)時間,并且增強(qiáng)與其共同導(dǎo)入的BDNF基因表達(dá)強(qiáng)度。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2498448