【摘要】： 研究目的通過對大鼠血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)體外不同條件的培養(yǎng),檢測其細(xì)胞增殖、表型基因SM22α和骨架蛋白表達(dá)的變化,探討細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖與細(xì)胞骨架蛋白變化之間的關(guān)系,為研究VSMC細(xì)胞骨架重構(gòu)在相關(guān)疾病中的作用提供新依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分組體外貼壁法培養(yǎng)大鼠腹主動(dòng)脈VSMCs,實(shí)驗(yàn)分別取2代(p2),4代(p4),6代(p6)細(xì)胞。每代細(xì)胞貼壁后用0.5%NSC DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后,試驗(yàn)分組:血清組:同步化后細(xì)胞用12%NSC的DMEM培養(yǎng)72h,收集細(xì)胞;血清饑餓組:同步化后細(xì)胞用12% NSC的DMEM培養(yǎng)72h,細(xì)胞處在合成期,再血清饑餓48h,收集細(xì)胞。各組細(xì)胞用考馬斯亮藍(lán)觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu),用電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),用熒光免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞骨架,用5-BrDU標(biāo)記細(xì)胞增殖情況,用RT-PCR檢測VSMC表型標(biāo)志基因SM22α的表達(dá)。每代細(xì)胞做同樣的試驗(yàn)。 5-BrDU免疫組織化學(xué)染色每組各取3張圓玻片做免疫組織化學(xué),具體步驟如下:將細(xì)胞載玻片用0.01%PBS沖洗后,用含0.3%雙氧水的甲醇封閉40 min;2N鹽酸37℃1h;正常養(yǎng)血清封閉20min,以上各步之間用0.01%PBS沖洗3次。5-BrDU抗體(1:300)4℃過夜;二抗(1:50)37℃30min;SABC 37℃20min;DAB顯色3min,以上各步之間用0.01%PBS沖洗3次。脫水,二甲苯透明,封片顯微鏡下觀察。每張切片都進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù),每組陽性標(biāo)記細(xì)胞以X±s表示,用t檢驗(yàn)有顯著性差異。 熒光免疫組織化學(xué)染色每組各取3張細(xì)胞載玻片做免疫組織化學(xué),步驟如下:將細(xì)胞載玻片用0.01%PBS沖洗后,用0.3% Triton-100封閉30min;正常養(yǎng)血清封閉40min;一抗體(1:400)4℃過夜;二抗(1:500)37℃60min;液體石蠟油封片,熒光顯微鏡下觀察,并進(jìn)行光密度分析,每組以平均光密度置分析,用t檢驗(yàn)有顯著性差異。RT-PCR檢測將上述試驗(yàn)收集的細(xì)胞用一步法(Trizol試劑)提取總RNA,在20ul反應(yīng)體系中42℃50 min,70℃15min,逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3ul加入聚合酶連反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)體系,在50ul反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。聚合酶鏈反應(yīng):94℃變性50s,57℃退火50s,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析,同一試驗(yàn)重復(fù)3次。 電鏡將細(xì)胞按電鏡方法包埋和切片,在透視電鏡下觀察。 結(jié)果 一、VSMC增殖的變化免疫組織化學(xué)染色顯示:隨培養(yǎng)代數(shù)增加,標(biāo)記的增殖細(xì)胞越多,第6代標(biāo)記的增殖細(xì)胞最多。血清饑餓組較血清培養(yǎng)組的VSMC標(biāo)記的增殖細(xì)胞明顯減少。 二、表型基因SM22a表達(dá)變化RT-PCR結(jié)果表明,在體外培養(yǎng)的VSMC低代數(shù)(p2)細(xì)胞血清培養(yǎng)時(shí)SM22α基因有微量表達(dá),隨著代數(shù)的增加SM22a的mRNA的表達(dá)水平逐漸降低,至第6代(P6)幾乎不表達(dá)。這表明在體外培養(yǎng)的VSMC隨代數(shù)的增多,細(xì)胞的表型也逐漸有收縮型變?yōu)楹铣尚�。血清饑餓后,SM22a的mRNA水平迅速上升,但隨培養(yǎng)代數(shù)的增加該基因表達(dá)水平逐漸降低。血清因素對細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化起重要作用;血清饑餓能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞表型,但隨培養(yǎng)代數(shù)的增加這種逆轉(zhuǎn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用逐漸降低。 三、細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)的變化熒光免疫組織化學(xué)染色顯示,血清培養(yǎng)條件下SMα-actin隨培養(yǎng)代數(shù)的增加其表達(dá)減少,血清饑餓培養(yǎng)SMα-actin表達(dá)上調(diào)。但隨培養(yǎng)代數(shù)的增加,其表達(dá)減少,至第6代僅有少量細(xì)胞表達(dá)。血清培養(yǎng)條件下隨培養(yǎng)代數(shù)的增加β-Tubulin和Desmin表達(dá)減少,血清饑餓后上調(diào)也不明顯,至第6代基本不表達(dá)。血清饑餓后細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)增多,但在高代數(shù)時(shí)血清饑餓不能逆轉(zhuǎn)β Tubulin和Desmin的重新表達(dá)。 四、超微結(jié)構(gòu)的變化電鏡下觀察到血清培養(yǎng)組胞漿中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細(xì)胞器增多,有大量的分泌小泡;血清饑餓組胞漿中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細(xì)胞器明顯減少。隨培養(yǎng)代數(shù)的增加,第8代與第3代相比,胞漿內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌小泡均增多,呈明顯的合成型特征。 結(jié)論 1.血清培養(yǎng)隨細(xì)胞代數(shù)的增多,細(xì)胞表型標(biāo)志基因SM22a及細(xì)胞骨架蛋白SM-a-actin、β-Tubulin和Desmin表達(dá)逐漸減少、細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),至第6代SM22a、β-Tubulin和Desmin表達(dá)消失。 2.血清饑餓培養(yǎng)能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞表型基因SM22a及細(xì)胞骨架蛋白SM-a-actin、β-Tublin和Desmin表達(dá),但至第6代不能逆轉(zhuǎn)β-Tubulin和Desmin的表達(dá)。 3.β-Tubulin和Desmin在傳代培養(yǎng)第6代表達(dá)消失,并血清饑餓培養(yǎng)也不能逆轉(zhuǎn)。提示:β-Tubulin和Desmin可作為分泌型病理性增殖VSMC的的鑒定標(biāo)志。 4.VSMC表型、增殖和骨架蛋白表達(dá)之間存在內(nèi)在的聯(lián)系,它們在維持細(xì)胞形態(tài)、收縮功能和血管重構(gòu)方面可能起了重要作用。但它們之間的因果關(guān)系有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2497287