發(fā)布時(shí)間：2019-06-05 10:58

【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)感染是全世界最重要的公共衛(wèi)生問題之一,嚴(yán)重危害人類健康。盡管預(yù)防疫苗免疫降低了乙肝發(fā)生率,但目前全世界仍有約4億HBV感染者,當(dāng)前的藥物治療方法尚不足于應(yīng)對(duì)該挑戰(zhàn),因此迫切需要發(fā)展新的更為有效的治療手段以對(duì)付HBV的威脅。RNAi是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)序列特異性抑制基因表達(dá)的機(jī)制,將RNAi技術(shù)應(yīng)用于包括病毒性肝炎等在內(nèi)的疾病治療已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn),而獲得兼具高效抑制特性和保守性特征的RNAi靶位是RNAi治療方法獲得成功應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。本研究以生物信息學(xué)為輔助,通過建立多基因型HBV細(xì)胞和小動(dòng)物表達(dá)模型,對(duì)HBV基因組上潛在的siRNA靶點(diǎn)進(jìn)行了規(guī)模化篩選和驗(yàn)證,獲得多個(gè)具有良好應(yīng)用潛力的siRNA靶點(diǎn),為進(jìn)一步應(yīng)用RNAi技術(shù)開發(fā)新型乙肝治療方法提供重要基礎(chǔ)。 本研究首先通過Genbank數(shù)據(jù)庫獲得623個(gè)已報(bào)道的HBV全基因組序列,應(yīng)用GCG生物信息學(xué)工作站對(duì)其進(jìn)行全基因組的序列保守性分析,獲得同源性為95%以上的高保守序列區(qū)段。采用步移法設(shè)計(jì)可靶向上述高保守序列區(qū)段的siRNA,并通過RNAi脫靶效應(yīng)分析軟件進(jìn)行分析,初篩獲得40個(gè)可識(shí)別不同位點(diǎn)并具有高保守特征的候選siRNA靶點(diǎn)序列,并以pSUPER為載體分別構(gòu)建了相應(yīng)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,用于進(jìn)行進(jìn)一步的篩選實(shí)驗(yàn)。本研究采用與HBV 1.3倍體克隆質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同siRNA對(duì)HBV的抑制效率。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的5個(gè)分屬C1、D1、Ae基因型的HBV 1.3倍體克隆在Huh-7細(xì)胞中建立了體外HBV瞬時(shí)表達(dá)模型,結(jié)果顯示其均可有效在Huh-7細(xì)胞中表達(dá)HBV重要標(biāo)志性抗原HBsAg與HBeAg。同時(shí)通過對(duì)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒用量配比的比較分析,確定了較有利于篩選高效靶點(diǎn)的檢測(cè)條件。在此基礎(chǔ)上,將本研究構(gòu)建的40個(gè)包含候選siRNA表達(dá)元件的質(zhì)�？寺》謩e與上述HBV 1.3倍體克隆以1:10的用量比例對(duì)Huh-7細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),檢測(cè)不同靶點(diǎn)siRNA對(duì)HBV蛋白表達(dá)的抑制能力。結(jié)果顯示,本研究選擇設(shè)計(jì)的40個(gè)siRNA可在不同程度上抑制HBV的表達(dá),其中部分靶點(diǎn)的siRNA體現(xiàn)出良好的抑制效果(部分靶點(diǎn)已申請(qǐng)發(fā)明專利,申請(qǐng)?zhí)?200810110686.4)。本研究選擇了其中3個(gè)抑制效率較好的siRNA靶點(diǎn)(B244、B245、B376)用于進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。通過CCK8檢測(cè)細(xì)胞毒性與細(xì)胞活力,和干擾素相關(guān)基因STAT-1及OSA-1表達(dá)水平檢測(cè)顯示上述3個(gè)靶點(diǎn)siRNA在細(xì)胞中的表達(dá)不會(huì)引起的細(xì)胞活性及干擾素相關(guān)基因基因轉(zhuǎn)錄水平的異常變化,顯示其無脫靶效應(yīng)。 RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗病毒治療研究中另一重要方面是如何有效地將siRNA或siRNA表達(dá)元件導(dǎo)入靶細(xì)胞中。應(yīng)用HBV表達(dá)細(xì)胞株HepG2-N10,本研究探討了通過重組慢病毒載體和化學(xué)修飾siRNA的方式導(dǎo)入siRNA抑制HBV表達(dá)的可行性。本研究分別構(gòu)建了可表達(dá)靶向B1579、B1881、B2391、B2393的siRNA的重組慢病毒,轉(zhuǎn)導(dǎo)HBV表達(dá)細(xì)胞株HepG2-N10后檢測(cè)結(jié)果顯示可顯著抑制HBV的表達(dá)。本研究同時(shí)合成了可靶向B244、B376的siRNA,以及針對(duì)同樣靶點(diǎn)的分別經(jīng)5'端甲氧基修飾、磷酸化修飾和固醇修飾的siRNA,對(duì)HepG2-N10細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化學(xué)合成的siRNA均能有效下調(diào)HepG2-N10細(xì)胞HBV蛋白的表達(dá),其中經(jīng)修飾后的siRNA可表現(xiàn)出更好的抑制效果。 為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究獲得的siRNA在動(dòng)物模型體內(nèi)對(duì)HBV表達(dá)的抑制效果,本研究應(yīng)用尾靜脈高壓注射法和不同基因型的HBV 1.3倍體克隆建立了HBV小鼠模型。通過檢測(cè)血清樣品中HBsAg、HBeAg的表達(dá)及HBV-DNA的拷貝數(shù)評(píng)估靶向B244、B245及B376的siRNA在動(dòng)物模型對(duì)HBV表達(dá)的抑制效果,結(jié)果顯示本研究獲得的靶向HBV的siRNA在小鼠體內(nèi)可顯著抑制不同基因型的HBV的表達(dá)與復(fù)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 魯毅;李任峰;徐萍;王三虎;田獻(xiàn)禮;;RNAi的抗病毒機(jī)制及應(yīng)用[J];生命的化學(xué);2011年04期

2 陳錦;;慢性乙型肝炎患者的健康教育及其效果評(píng)價(jià)[J];白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年04期

3 葉寬萍;王少華;孫子林;黃艷;;大鼠PPARγ shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J];江蘇醫(yī)藥;2011年13期

4 李鈳;楊剛毅;李伶;李清明;孟凡萍;唐毅;Guenther Boden;;RNA干擾對(duì)脂聯(lián)素在3T3-L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)的影響[J];中國(guó)糖尿病雜志;2007年10期

5 易韜;綦小蓉;;骨橋蛋白R(shí)NA干擾對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞作用的研究[J];四川解剖學(xué)雜志;2011年02期

6 李莉;洪曉綠;李剛;;MicroRNAs與病毒性肝炎的研究進(jìn)展[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2011年07期

7 龐念德;李曉云;;乙型肝炎病毒感染對(duì)慢性乙型肝炎病毒感染者胃粘膜病變的影響[J];工企醫(yī)刊;2011年03期

8 肖義濤;羅來敏;張睿;;慢病毒介導(dǎo)COX-2基因的shRNA對(duì)子宮內(nèi)膜癌侵襲力的影響[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2011年07期

9 李玉紅;宋文濤;廖漢林;畢勇毅;;CYP4F3基因RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建[J];江蘇醫(yī)藥;2011年14期

10 謝煜文;;鐘落潭地區(qū)學(xué)生乙型肝炎普查結(jié)果分析[J];中國(guó)醫(yī)藥指南;2011年18期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張輝;于力;朱龍英;萬延慧;朱為民;;Hair-pin RNA介導(dǎo)的番茄抗TYLCV效果初步研究[A];慶祝中國(guó)園藝學(xué)會(huì)創(chuàng)建80周年暨第11次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)論文摘要集[C];2009年

2 李艷;嚴(yán)明;;RNA干擾[A];第一屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

3 閆虎斌;陸智明;;基于RNA干擾的植物抗病毒育種原理及研究進(jìn)展[A];中國(guó)柑橘科技創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略論壇暨中國(guó)柑橘學(xué)會(huì)2007年年會(huì)論文集[C];2007年

4 趙午莉;邵榮光;;MR-1基因在白血病K562細(xì)胞中的功能研究[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

5 陳始明;陶澤璋;肖伯奎;;RNA干擾hTERT基因抑制Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的實(shí)驗(yàn)研究[A];湖北省抗癌協(xié)會(huì)頭頸腫瘤專業(yè)委員會(huì)第四次學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2005年

6 潘q，

本文編號(hào)：2493478