【摘要】： 志賀菌屬(shigella)細(xì)菌通稱痢疾桿菌,是一類具有高度傳染性和危害嚴(yán)重的革蘭氏陰性腸道致病菌,能夠通過侵襲腸上皮細(xì)胞引起患者典型的菌痢癥狀(發(fā)熱、腹痛、腹瀉)。志賀菌分4群37種血清型,在我國(guó)主要的流行菌群為福氏(86%),福氏志賀菌最主要的血清型為2a(80%)。臨床感染痢疾桿菌可以導(dǎo)致痢疾,其癥狀以發(fā)熱、脫水和便血為特征。痢疾是世界上,尤其是發(fā)展中國(guó)家重要的傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織公告報(bào)道,全球每年菌痢患者達(dá)1.647億,有1.632億分布于發(fā)展中國(guó)家,并導(dǎo)致150萬人死亡。在我國(guó),菌痢發(fā)病率也很高,其中福氏2a型占到50-70%。目前治療痢疾的主要方式是抗生素,但高達(dá)95%的臨床分離株對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性;最佳治療手段是疫苗,但對(duì)其致病機(jī)理和宿主的免疫保護(hù)機(jī)制還不很清楚。菌痢嚴(yán)重危害我國(guó)人們的健康,對(duì)痢疾桿菌進(jìn)行研究具有重要的意義。因此,福氏2a志賀氏菌的基礎(chǔ)研究對(duì)于我國(guó)衛(wèi)生防疫工作尤為重要。 在原核生物基因組中除了tRNA、rRNA和mRNA這三種我們很熟悉的RNA以外,目前已經(jīng)知道還含有許多編碼非常規(guī)調(diào)控的RNA。這些RNAs的長(zhǎng)度為50-400nt,通常由原核生物的基因間區(qū)編碼但是并不翻譯成蛋白質(zhì),因此被稱為非編碼小RNA,簡(jiǎn)稱小RNA(sRNA)或非編碼RNA(ncRNA)。近年來,隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,在原核生物體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了上百種sRNA分子,這些sRNA分子具有多樣的生物學(xué)功能。小RNAs作為一類新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控子已經(jīng)引起了高度的重視。它們?cè)诩?xì)菌中發(fā)揮著多種調(diào)控功能,有助于細(xì)菌對(duì)生理系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控以便適應(yīng)迅速變化的環(huán)境。因而深入認(rèn)識(shí)這些sRNAs可能開辟一個(gè)新的研究領(lǐng)域,它們可能代表著一個(gè)新層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。 人們現(xiàn)在已認(rèn)識(shí)到sRNAs參與許多有機(jī)體的基因調(diào)節(jié),在細(xì)菌中行使諸如翻譯激活、翻譯抑制、持家sRNAs、密度感應(yīng)系統(tǒng)、蛋白的降解、離子動(dòng)態(tài)平衡、糖代謝和生長(zhǎng)依賴性外膜蛋白表達(dá)調(diào)控等多種功能,有人把這些sRNAs稱為“凌駕于”基因組之上的調(diào)控成分。雖然現(xiàn)在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的sRNAs在迅速增加,但是它們中的大部分功能都還未知,從目前積累的知識(shí)分析,細(xì)菌可能借助于這些sRNAs對(duì)它們的生理系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控以便適應(yīng)迅速變化的環(huán)境。因而深入認(rèn)識(shí)這些sRNAs可能開辟一個(gè)新的研究領(lǐng)域,因?yàn)樗鼈兛赡艽碇粋�(gè)新層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。 功能分析表明sRNAs是進(jìn)行細(xì)菌調(diào)控研究中一直被忽略的一環(huán)。最新認(rèn)識(shí)到的sRNAs的生理功能已經(jīng)填補(bǔ)了我們對(duì)細(xì)菌離子動(dòng)態(tài)平衡、糖代謝和生長(zhǎng)依賴性外膜蛋白表達(dá)調(diào)控知識(shí)的空白。對(duì)痢疾桿菌全基因組sRNAs的功能進(jìn)行研究,必將促進(jìn)對(duì)該菌生理學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化以及致病機(jī)理等方面的研究,為痢疾的藥物開發(fā)提供新的作用靶標(biāo),為痢疾桿菌疫苗研制提供一個(gè)新的思路。 首先,本研究根據(jù)目前發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌的sRNAs的本身的特點(diǎn),利用生物信息學(xué),根據(jù)基因組之間的序列對(duì)比、RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析以及對(duì)非依賴性終止子分析等方法對(duì)福氏2a志賀氏菌301毒力大質(zhì)粒(pCP301)上的sRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè),采用Northern blot對(duì)預(yù)測(cè)出的sRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。本研究成功預(yù)測(cè)了301毒力大質(zhì)粒上的6個(gè)sRNA;綜合文獻(xiàn)報(bào)道和網(wǎng)絡(luò)信息初步預(yù)測(cè)sf301基因組5個(gè)功能未知的sRNA:IS061 sRNA、IS102 sRNA、C0719 sRNA、tke1 sRNA和ryfA sRNA(http://www.sanger.ac.uk)。 研究證明sRNA在細(xì)菌的物質(zhì)代謝、環(huán)境適應(yīng)、群體感應(yīng)和細(xì)菌毒力發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。本研究采用改進(jìn)的λ-Red重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了sf301的8個(gè)sRNAs的缺失突變體(簡(jiǎn)稱sf301ΔsRNAs),分別是預(yù)測(cè)的3個(gè)質(zhì)粒編碼sRNAs和sf301基因組5個(gè)功能未知的sRNAs,并對(duì)突變株進(jìn)行了生理生化特征研究。結(jié)果表明:這8個(gè)sRNA的缺失對(duì)菌體的物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)影響不大。 接下來本文對(duì)sf301ΔsRNAs對(duì)sf301毒力的影響進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本研究通過sf301ΔsRNAs與野生株的HeLa細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性侵襲力、小鼠肺部競(jìng)爭(zhēng)性侵襲感染能力和豚鼠角膜侵染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行毒力評(píng)價(jià)研究,驗(yàn)證預(yù)測(cè)的sRNA和基因組上已報(bào)道但是功能未知的sRNA是否對(duì)細(xì)菌毒力的發(fā)揮起到了重要的調(diào)控作用。結(jié)果表明:基因組上的C0719 sRNA和IS061 sRNA的缺失造成了sf301的HeLa細(xì)胞侵襲力及小鼠肺部侵襲力的增強(qiáng);毒力大質(zhì)粒預(yù)測(cè)的ln3 sRNA的缺失使得sf301的HeLa細(xì)胞侵襲力及小鼠肺部侵襲力的減弱。 對(duì)細(xì)菌不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較是蛋白質(zhì)學(xué)研究中很重要的一個(gè)方面,這包括同一株菌在不同培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)組的變化的研究、同一細(xì)菌的不同菌株的蛋白質(zhì)組比較以及同一菌株的突變菌株和野生菌株的蛋白質(zhì)組的比較。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)sf301ΔsRNAs與sf301的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較,應(yīng)用雙向凝膠電泳建立了不同生長(zhǎng)時(shí)期野生株和sRNAs突變株的雙向電泳圖譜,并對(duì)差異點(diǎn)進(jìn)行了膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明:通過比較8株突變株37℃晚期的和sf301ΔIS061中期的蛋白質(zhì)組,發(fā)現(xiàn)了31種蛋白質(zhì)在突變株與野生株中存在差異,我們對(duì)這些蛋白進(jìn)行了功能分析。發(fā)現(xiàn)sRNAs的缺失并沒有對(duì)痢疾桿菌的蛋白表達(dá)量造成明顯的影響,但是我們發(fā)現(xiàn)了可能對(duì)痢疾桿菌毒力造成影響的蛋白質(zhì)OspC3和可能與sRNA調(diào)控機(jī)制有關(guān)系的蛋白質(zhì)OmpA,為下一步研究sRNA的調(diào)控功能提供了條件。 綜上所述,本研究預(yù)測(cè)出pCP301的6個(gè)sRNAs,并進(jìn)行驗(yàn)證;成功地構(gòu)建了8株sf301ΔsRNAs突變體并根據(jù)生化特性變化、細(xì)胞和動(dòng)物侵襲實(shí)驗(yàn)揭示出sRNAs與痢疾桿菌致病性之間的關(guān)系;通過與蛋白質(zhì)組技術(shù)相結(jié)合分析sRNAs的調(diào)控功能。本研究構(gòu)建的8株sf301ΔsRNAs為進(jìn)一步研究sRNA的功能奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2489581