【摘要】： 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種抗原驅(qū)動(dòng)由CD4+CD28+Th1細(xì)胞介導(dǎo)的全身性自身免疫病。鑒于RA病人的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞變形與免疫功能的改變密切相關(guān),近年來國外趨向于將具有免疫調(diào)節(jié)作用的藥物作為治療RA的第一線藥,并對(duì)RA新的免疫治療策略進(jìn)行了廣泛的研究�？诜褪芫褪亲跃攀甏鷩H上興起的治療RA的特異性免疫療法之一。已有的基礎(chǔ)與臨床研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)口服雞或牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受用于治療RA這一重要策略的科學(xué)性、特異性和可行性。 然而,縱觀目前國際上探索免疫耐受策略治療RA所使用的CⅡ均是天然提取制備的,很難保證提取產(chǎn)物天然結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性,也缺乏正確的空間構(gòu)象和適當(dāng)?shù)男揎?這樣的耐受原由于缺少在構(gòu)象上相關(guān)的表位,難以誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)于天然抗原的免疫耐受;而且CⅡ在體內(nèi)的半衰期較短,病人需要反復(fù)給藥,從而限制了CⅡ的大規(guī)模使用。更況,亦有研究顯示,CⅡ并非對(duì)所有RA都具有很好的療效。針對(duì)這一重大問題,國際上相繼開展了針對(duì)CⅡ抗原結(jié)構(gòu)的深入細(xì)致研究。隨后進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),CⅡ中真正發(fā)揮功能的區(qū)域是定位于CⅡ-CB11片段中260-270aa,稱為CⅡ耐受原表位2(Collagen tolerogenic epitope 2,CTE2),單獨(dú)給予包含該表位的化學(xué)合成或基因重組的多肽能夠?qū)δz原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)癥狀起到緩解作用,并能顯著降低血清及關(guān)節(jié)液中抗CⅡ抗體水平。CⅡ在結(jié)構(gòu)上比較保守,在各物種間都具有相似的表位,而雞CⅡ在190-200aa處具有另一獨(dú)特的耐受原表位,在其它物種間并未發(fā)現(xiàn),我們稱其為CTE1。這些耐受原表位都含HLA-DR1/DR4的結(jié)合位點(diǎn)和與T細(xì)胞反應(yīng)的抗原表位。通過清除T細(xì)胞受體表位的不同氨基酸的側(cè)鏈或替代T細(xì)胞結(jié)合氨基酸,可以阻斷HLA-抗原肽復(fù)合物與T細(xì)胞形成氫鍵連接,從而抑制抗原提呈反應(yīng),為RA的口服耐受治療策略提供了深入研究的方向。這也就是近年來國際上十分推崇的耐受原表位肽(Collagen tolerogenic epitopes,CTE)或變構(gòu)肽(Altered peptide ligand,APL),它們歸屬于小分子藥物生物活性肽中的免疫活性肽類。因此,研制小分子免疫活性肽諸如耐受原表位肽或變構(gòu)肽進(jìn)行其治療則是該研究領(lǐng)域近年來的重大進(jìn)展之一。的確,在RA動(dòng)物模型中已經(jīng)證實(shí)化學(xué)合成或重組表達(dá)的含有這些表位的免疫活性肽具有顯著的治療或緩解作用。尤為突出的是,美國、加拿大兩國在2000年已完成APL治療多發(fā)性硬化的Ⅰ\Ⅱ臨床試驗(yàn),目前正在進(jìn)行Ⅲ期試驗(yàn)。為此,我們先前的研究首次從CCOL2A1中克隆了僅含編碼CTE1-2(190-270aa)的基因片段,并設(shè)計(jì)構(gòu)建了相應(yīng)的酵母和原核表達(dá)載體。本研究對(duì)我室創(chuàng)新性設(shè)計(jì)構(gòu)建成的新型重組雞Ⅱ型膠原特異性耐受原表位肽rcCTE1-2進(jìn)行了表達(dá)條件的優(yōu)化、純化鑒定以及對(duì)CIA小鼠抑制效應(yīng)進(jìn)行了觀察,并探索其相應(yīng)的作用機(jī)制。 毋容置疑,本研究的首要關(guān)鍵任務(wù)在于成功獲得高純度的rcCTE1-2耐受原表位肽。為此,我們首先對(duì)原核表達(dá)體系進(jìn)行了優(yōu)化,通過摸索調(diào)整表達(dá)過程中溫度、時(shí)間、誘導(dǎo)條件,最后得到rcCTE1-2原核表達(dá)的最優(yōu)條件:以1:100接種后,37℃、210rpm振蕩培養(yǎng)16h,加入1mM IPTG繼續(xù)于30℃培養(yǎng)4h,可獲得表達(dá)量達(dá)41%以上的包涵體。此外,在25℃及30℃誘導(dǎo)時(shí)還可看到在上清中存在部分的分泌性表達(dá)。rcCTE1-2表達(dá)菌種采用30%蔗糖高滲溶液進(jìn)行預(yù)處理,經(jīng)過3次超聲破碎后,破菌效果比較徹底,粘度顯著降低。包涵體需用含0.5% Triton X-100、2M NaCl及4M尿素的洗滌液洗滌2次效果較好。鑒于rcCTE1-2是被設(shè)計(jì)成的融合表達(dá),我們采用金屬螯合層析的方法,利用Ni-NTA樹脂可與組氨酸標(biāo)簽特異性結(jié)合的特性,一步即可獲得高純度的rcCTE1-2。并利用柱上復(fù)性結(jié)合透析復(fù)性的方式對(duì)其進(jìn)行復(fù)性得到可溶性的rcCTE1-2。經(jīng)Western-blot分析表明,所純化的rcCTE1-2可以和抗CⅡ單抗產(chǎn)生特異性結(jié)合,由此證明我們所表達(dá)純化的rcCTE1-2仍保持具有活性的功能表位。 我們知曉,膠原蛋白的合成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,它涉及翻譯后加工、糖基化等諸多種步驟,至少需要8種酶的參與。其中以脯氨酸羥化酶P4Hα、β兩個(gè)亞基的羥化作用尤為重要,它能使特異的膠原三肽重復(fù)序列Gly-X-Pro的脯氨酸殘基羥基化。羥化脯氨酸對(duì)于在生理?xiàng)l件下形成穩(wěn)定的膠原三螺旋是必需的。而由本研究室所構(gòu)建成功的rcCTE1-2原核表達(dá)載體是在大腸桿菌中表達(dá)的,與真核表達(dá)載體相比缺乏翻譯后的修飾,即無羥基化與糖基化。這種缺乏翻譯后修飾的重組膠原蛋白是否具有生物學(xué)功能?能否在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)有效地免疫耐受?其誘導(dǎo)耐受的機(jī)制如何?將是本研究中最為關(guān)注的問題。因此我們采用天然CCⅡ在AMMS/1雌性昆明小鼠中建立CIA模型,該模型的四肢關(guān)節(jié)腫脹程度、組織病理學(xué)表現(xiàn),血清內(nèi)抗CⅡ抗體水平與RA極為相似,完全符合RA模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)治療的標(biāo)準(zhǔn)要求。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,膠原免疫28d后,50μg/kg rcCTE1-2組與50μg/kg nCCⅡ均可明顯減輕四肢關(guān)節(jié)腫脹程度,與其它組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而與50μg/kg nCCⅡ組相比,50μg/kg rcCTE1-2組在抑制關(guān)節(jié)腫脹方面效果更好(P0.05)。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,CIA陽性對(duì)照組關(guān)節(jié)腔內(nèi)有明顯血管翳形成,滑膜增生,大量炎性細(xì)胞浸潤,關(guān)節(jié)軟骨變薄且失去完整性,幾乎觀察不到完整的骨小梁,骨髓腔內(nèi)分布大量的破骨細(xì)胞。50μg /kg nCCⅡ預(yù)防組和50μg/kg rcCTE1-2預(yù)防組滑膜增生減弱,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少,少見纖維物質(zhì)沉淀,基本看不到軟骨及骨的改變。而其余劑量組與陽性對(duì)照組相比沒有顯著改變。對(duì)CIA小鼠血清內(nèi)抗CⅡ抗體水平檢測(cè)結(jié)果顯示,與CIA陽性對(duì)照組相比,nCCⅡ與rcCTE1-2各劑量組都能夠降低小鼠體內(nèi)抗CⅡ抗體水平,而只有50μg/kg nCCⅡ組和5μg/kg、50μg/kg rcCTE1-2組與陽性對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)�？笴Ⅱ抗體被認(rèn)為是反映關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度最可靠的指標(biāo),其水平反映了RA早期階段炎癥和骨質(zhì)破壞的程度。由此證實(shí),未經(jīng)翻譯后修飾的rcCTE1-2能夠有效地預(yù)防CIA的發(fā)生及關(guān)節(jié)炎癥狀的嚴(yán)重程度。 為了進(jìn)一步探索rcCTE1-2預(yù)防CIA的機(jī)制,在nCCⅡ免疫38d后,我們分離了50μg/kg nCCⅡ和rcCTE1-2兩組小鼠脾細(xì)胞,檢測(cè)其培養(yǎng)上清液中Th3因子TGF-β及Th1因子IFN-γ含量。研究結(jié)果表明,nCCⅡ預(yù)防組與rcCTE1-2預(yù)防組脾細(xì)胞上清液中IFN-γ含量與CIA組相比都有顯著下降(P0.01),而rcCTE1-2組比nCCⅡ組具有更顯著的效應(yīng)(P0.05),CIA對(duì)照組的IFN-γ含量顯著高于陰性對(duì)照組(P0.01)。TGF-β檢測(cè)結(jié)果顯示,nCCⅡ預(yù)防組與rcCTE1-2預(yù)防組TGF-β分泌明顯高于CIA組與陰性對(duì)照組(P0.01),rcCTE1-2組又顯著高于nCCⅡ組(P0.05)。上述結(jié)果提示,50μg/kg rcCTE1-2和nCCⅡ都能夠?qū)IA小鼠細(xì)胞因子的分泌起到一定的調(diào)節(jié)作用,其機(jī)制可能為通過下調(diào)Th1型細(xì)胞因子的同時(shí)上調(diào)Th2型細(xì)胞因子的分泌來有效控制并減緩CIA的發(fā)生與發(fā)展的。 總之,本研究在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化出同時(shí)攜帶兩個(gè)耐受原表位的新型重組耐受原表位肽rcCTE1-2,經(jīng)CIA小鼠模型證實(shí)其能有效預(yù)防CIA發(fā)病率與發(fā)病嚴(yán)重程度,對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了一定的探討,為今后臨床進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),也為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療提供了更多更廣的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 汪龔澤;劉朝奇;楊建林;聶紀(jì)芹;;小鼠鈣網(wǎng)蛋白的原核表達(dá)和多克隆抗體的制備[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2011年04期

2 安薇;徐霞;;人脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備[J];中國免疫學(xué)雜志;2011年09期

3 王洋;余源;王衛(wèi)亮;陳陽;慈雅麗;田喜鳳;鄭佳;楊志宏;;藍(lán)氏賈第鞭毛蟲α-4賈第素的原核表達(dá)及純化[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2011年06期

4 劉世海;李榮華;王東陽;王麗嫻;夏海濱;;人白介素24單克隆抗體的制備與鑒定[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2011年09期

5 趙紅蕾;曹宏;孫月芳;田曉豐;;轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2功能片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];中國老年學(xué)雜志;2011年16期

6 王桂玲;王孝會(huì);都田趙;陳薇;姜佩家;;原核表達(dá)載體GST-RUNX3的構(gòu)建及其在大腸桿菌表達(dá)[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2011年04期

7 馮艷玲;劉彩紅;朱亞勤;;人源MAP3K7克隆及其GST融合蛋白的表達(dá)和鑒定[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年08期

8 趙勁松;黃嵐峰;王淑榮;;SPACR原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[J];中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2011年08期

9 劉瑩;厲建中;張俊平;;人的核糖體蛋白S3a基因克隆、表達(dá)、純化與亞細(xì)胞定位[J];藥學(xué)實(shí)踐雜志;2011年02期

10 吳麗紅;范沛;王叢莉;劉玉鵬;黃黎珍;施振旦;顧為望;;西藏小型豬Leptin及其受體胞外區(qū)片段的克隆及原核表達(dá)[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2011年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 李慎濤;歐陽紅生;張玉靜;張銳;廖曉萍;孫博興;張永亮;;豬肌生成抑制素基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2001年

2 袁菊;成軍;洪源;陶明亮;李康;石磊;靳亞平;;HCV反式調(diào)節(jié)基因p7TP2原核表達(dá)載體的構(gòu)建及融合蛋白表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)全國第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

3 鐘春燕;柳長柏;;pET15b-GFP-HCTP、pET15b-Apoptin-HCTP原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其意義[A];第十屆全國生化與分子藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2007年

4 王曉娟;鄔玉蘭;劉志剛;;甜蕎麥16KD過敏原基因的克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)2009年全國變態(tài)反應(yīng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

5 王瑞曉;習(xí)欠云;束剛;高萍;王松波;王麗娜;江青艷;張永亮;;豬垂體SSTR2胞外區(qū)Ⅰ、Ⅱ肽片段融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及純化[A];全國動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

6 寧鉑濤;湯永民;曹江;沈紅強(qiáng);錢柏芹;張海忠;張怡;郭莉;;抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9單鏈抗體原核表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)及活性鑒定[A];2005年華東六省一市血液病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2005年

7 寧鉑濤;湯永民;曹江;沈紅強(qiáng);錢柏芹;張海忠;張怡;郭莉;;抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9單鏈抗體原核表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)及活性鑒定[A];第10屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

8 王平;楊秀利;徐薇;儲(chǔ)以微;熊思東;;新分子ITIP的原核表達(dá)、純化及抗體制備[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

9 王秀敏;韓烈保;;豇豆蛋白酶抑制劑基因(CpTI)的克隆及其原核表達(dá)[A];全國植物分子育種研討會(huì)摘要集[C];2009年

10 楊宇;楊欣;孫欣;吳昊;吳江;;NT3—ABAD-DP—HA2-TAT融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 實(shí)習(xí)生 李鑫源;2011“英特爾-清華”全國大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實(shí)踐夏令營落幕[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 危少華;人重組IL-24基因治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2005年

2 鄭璐;BC047440的原核表達(dá)、多克隆抗體制備及其在蛋白質(zhì)水平表達(dá)的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

3 王（韋華）;豬源乙型腦炎病毒SXBJ07株全長基因組克隆分析及ELISA檢測(cè)方法的建立[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2009年

4 吳漢林;人NIT1基因cDNA的克隆、原核表達(dá)及抗體制備[D];四川大學(xué);2005年

5 段冷昕;梅花鹿茸多肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其抗肝纖維化作用[D];吉林大學(xué);2007年

6 姜海龍;狂犬病病毒糖/核融合基因DNA疫苗的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

7 鄧尚龍;石斑魚抗菌肽Hepcidin基因的克隆、表達(dá)與抗菌活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

8 張立娜;新城疫病毒不同毒株HN蛋白多肽片段的免疫原性差異比較分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2007年

9 呂淑敏;擬黑多刺蟻毒蕈堿型乙酰膽堿受體基因（mAchR）及抑瘤基因（QM）的克隆與表達(dá)研究[D];陜西師范大學(xué);2008年

10 楊玉菊;GPMVF、HN及NP基因的多表達(dá)系統(tǒng)與DNA疫苗的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉曉明;胸腺肽α1-干擾素α2b融合基因克隆表達(dá)及產(chǎn)物活性分析[D];吉林大學(xué);2007年

2 孟文麗;江浙短尾蝮蛇纖溶酶原激活劑的原核表達(dá)、純化及其鑒定[D];福建醫(yī)科大學(xué);2008年

3 樊可;重組人巨細(xì)胞病毒基因在大腸桿菌中的表達(dá)[D];大連理工大學(xué);2011年

4 王莉;克隆與表達(dá)草魚干擾素基因及其抗彈狀病毒效果的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

5 王英南;人皰疹病毒7型被膜蛋白pp85的原核表達(dá)和應(yīng)用[D];青島大學(xué);2005年

6 張苗;家蠶SCI-SB基因克隆及其原核表達(dá)的研究[D];浙江大學(xué);2005年

7 周丹;豬細(xì)小病毒SC1株VP2基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

8 郝煒;中國葡萄屬野生種抗白粉病基因原核表達(dá)與抗體制備[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2005年

9 郭志剛;雞白細(xì)胞介素2基因與雞毒支原體H3株TM-1基因的串聯(lián)及原核表達(dá)[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

10 劉英麗;豬囊尾蚴cYI基因重組子的建立及表達(dá)[D];河北醫(yī)科大學(xué);2006年

，

本文編號(hào)：2486481