【摘要】：血供再通治療是目前缺血性心臟病的主要治療手段。在血供再通治療中缺血再灌注損傷是普遍存在的病理變化。它涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等環(huán)節(jié),嚴重影響了血供再通治療的效果。如何在冠脈血運重建治療中保護心臟,避免缺血再灌注損傷已經(jīng)成為心血管研究領(lǐng)域的熱點之一。 目前這個領(lǐng)域中一個主要的研究方向是利用預(yù)處理的方法喚起心臟內(nèi)在的保護信號通路。預(yù)處理的主要方法包括缺血前處理和缺血后處理,但是它們各自的特點限制了臨床上的應(yīng)用。利用藥物模擬預(yù)處理對心肌的保護機制是另一種積極的探索,其中粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是主要候選藥物之一。然而,G-CSF 1臨床試驗結(jié)果的不一致提示復(fù)雜的臨床背景可能影響了G-CSF對心臟的保護效果,因此對G-CSF在病理環(huán)境下的作用機制進行更加深入的研究尤其重要。 熱休克因子1(Heat Shock Factor 1, HSF1)及其調(diào)節(jié)的熱休克反應(yīng)是機體對抗各種損傷的重要內(nèi)在保護機制。HSF1可以激活多種熱休克蛋白,它們具有多種功能,可以充當(dāng)分子伴侶,幫助蛋白折疊、轉(zhuǎn)運,在生長、發(fā)育、炎癥等多種病理生理過程中都發(fā)揮了重要作用。 已有研究發(fā)現(xiàn)HSF1在心臟缺血再灌注損傷中可以發(fā)揮抗凋亡、抗炎癥、增加心肌舒縮能力等多種作用。同時,在各種不同的病理狀態(tài)下,或是各種臨床藥物的干預(yù)下,HSF1的表達水平和活性狀態(tài)都會發(fā)生變化。 目前G-CSF對心臟的預(yù)處理保護機制主要集中在活化內(nèi)源性的保護激酶。作為一種重要的內(nèi)源保護性因子,HSF1是否參與了G-CSF對心臟的保護作用,還有待進一步闡明。這在很大程度上有助于揭示G-CSF在臨床應(yīng)用中效果不一致的原因,并更深入的理解G-CSF對心臟保護作用的機制。 第一部分心臟缺血再灌注損傷中HSF1是G-CSF保護作用重要的信號分子 假設(shè)：粒細胞集落刺激因子(G-CSF)能夠通過激活心臟內(nèi)的保護激酶在缺血再灌注損傷中保護心臟。熱休克因子1 (HSF1)是心臟缺血再灌注損傷中重要的內(nèi)在保護因子,有可能也參與了G-CSF對心臟的保護作用。 目的：本部分實驗是為了研究HSF1是否參與了G-CSF對心臟缺血再灌注損傷的保護機制。 方法：(1)以同窩的野生型小鼠做對照,在HSF1基因敲除小鼠上連續(xù)3天皮下給予G-CSF (100μg/kg/day),然后通過結(jié)扎冠狀動脈前降支,缺血30分鐘后再灌注24小時。通過超聲、血流動力學(xué)和組織染色的方法,評價心功能和心臟梗死范圍。(2)在原代培養(yǎng)心肌細胞給予G-CSF,并將HSF1的siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞,經(jīng)由過氧化氫刺激24小時,通過AnnexinⅤ染色,觀察G-CSF減少心肌細胞凋亡的情況,并比較HSF1siRNA干擾后是否影響G-CSF對心肌細胞的保護作用。 結(jié)果：(1)在野生型小鼠中,給予G-CSF能夠明顯改善心功能,降低梗死面積；而在HSF1敲除小鼠中,G-CSF對心臟的保護作用消失。(2)在未進行HSF1 RNA干擾的心肌細胞中,給予G-CSF能夠顯著減少過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡；而當(dāng)HSF1表達水平下降后(RNA干擾組),G-CSF不能減少心肌細胞的凋亡 結(jié)論：HSF1參與了G-CSF對缺血再灌注損傷中心臟的保護作用并發(fā)揮了重要作用。 第二部分HSF1/STAT3是G-CSF對缺血再灌注損傷心臟保護作用的重要信號通路 假設(shè)：粒細胞集落刺激因子(G-CSF)能夠通過Jak2/STAT3信號通路減少缺血再灌注對心臟的損害。熱休克因子1 (HSF1)是心臟的內(nèi)在保護因子之一,有可能與STAT家族相互作用。 目的：研究心臟缺血再灌注損傷中,G-CSF的保護作用是否與HSF1和STAT3的相互作用相關(guān)。 方法：(1)在心臟體外灌流模型和培養(yǎng)的心肌細胞中檢測HSF1表達水平和活性與施加G-CSF的關(guān)系。(2)在乳鼠心肌細胞中觀察G-CSF對STAT3磷酸化的作用。(3)在抑制STAT3活性的情況下,觀察G-CSF對HSF1的作用是否發(fā)生變化。(4)分別在降低HSF1表達水平和抑制HSF1活性的情況下,觀察G-CSF對STAT3的活化是否改變。(5)通過免疫共沉淀技術(shù),觀察HSF1和STAT3的相互作用。 結(jié)果：(1)在體外灌流心臟中,缺血再灌注損傷和G-CSF處理并不改變HSF1的轉(zhuǎn)錄水平；利用G-CSF處理乳鼠心肌細胞,HSF1 mRNA水平并不隨時間變化而變化,但是可以增加HSF1的磷酸化(Ser230)水平,進而促進熱休克蛋白(HSP)的生成。(2)G-CSF可以活化心肌細胞中的STAT3,并呈現(xiàn)時間依賴性。(3)用S3I-201抑制STAT3的活性后,G-CSF對HSF1的活化明顯被削弱。(4)分別采用RNA干擾HSF1和用KNK437抑制HSF1的方法,觀察到G-CSF對STAT3的激活明顯減弱。(5)進一步的免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),HSF1和STAT3存在相互作用,G-CSF處理后兩者結(jié)合增加,這種變化可以被各自的抑制劑所抑制。 結(jié)論：G-CSF在缺血再灌注損傷中并不改變HSF1的表達水平,而是通過提高HSF1活性的方式增強心肌細胞的內(nèi)在保護機制；HSF1和STAT3可能通過直接結(jié)合,在G-CSF作用下以共激活因子的形式發(fā)揮保護作用。 重要性和創(chuàng)新點 1)揭示了在心臟缺血再灌注損傷中,G-CSF藥物預(yù)處理的保護機制與熱休克因子1 (HSF1)及其調(diào)控的熱休克反應(yīng)相關(guān)。HSF1的表達水平和活性狀態(tài)直接關(guān)系到G-CSF對心臟保護作用的效果。 2)將心肌細胞內(nèi)在的HSF1保護機制和預(yù)處理中保護激酶(RISK)信號通路中的STAT3聯(lián)系在一起,對預(yù)處理保護機制的分子網(wǎng)絡(luò)起到一定完善作用。 3)明確了HSF1與STAT3是G-CSF預(yù)處理保護機制中一對重要的調(diào)節(jié)因子,并且不同于以往的觀點,STAT3不但是缺血晚期反應(yīng)的重要的信號分子,還可能通過HSF1在再灌注早期也發(fā)揮保護作用。 4)針對G-CSF臨床試驗與基礎(chǔ)研究中保護效果的不一致,根據(jù)本實驗的結(jié)果,提出了一種假設(shè),即復(fù)雜的臨床背景干擾了HSF1在機體內(nèi)的狀況,G-CSF無法正常喚起心臟內(nèi)在的保護機制,造成臨床治療效果的不一致。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363.22

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本文編號：2479556