【摘要】： 自1817年以來,霍亂弧菌已引起7次霍亂世界大流行,迄今尚未得到有效控制,仍然是全球性的重要衛(wèi)生問題之一。雖然近年來對于霍亂弧菌的生物學(xué)特性的認(rèn)識取得了長足進(jìn)展,但關(guān)于該菌在霍亂疫區(qū)季節(jié)性流行、流行間歇期的生存問題以及越冬機(jī)制依舊困擾著微生物學(xué)者。自由生活阿米巴原蟲(free-living amoebae, FLA)廣泛分布于自然界中,它作為一些重要的致病菌如軍團(tuán)菌、分枝桿菌和副衣原體等的儲存宿主和傳播媒介越來越受到人們的重視。FLA原蟲,尤其是其包囊,能抵抗不利的溫度、pH、殺蟲劑、化學(xué)藥品以及消毒劑的作用,同時(shí)也對其胞內(nèi)菌在抵抗不利的物理和生化環(huán)境時(shí)起到重要的保護(hù)作用。FLA原蟲是霍亂弧菌復(fù)雜的水生態(tài)環(huán)境中的重要成員。為此,本課題通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察FLA原蟲與霍亂弧菌之間的相互關(guān)系,探討FLA原蟲在不同溫度以及消毒劑作用下對霍亂弧菌存活的影響,可為闡明自由生活阿米巴原蟲對霍亂弧菌在外環(huán)境中生存的影響以及霍亂的防治提供新的思路、策略和理論依據(jù)。 28℃實(shí)驗(yàn)環(huán)境下以埃爾托型霍亂弧菌、古典型霍亂弧菌以及非01群霍亂弧菌分別感染多噬棘阿米巴原蟲。Gimenez染色結(jié)果顯示,共培養(yǎng)8hr后霍亂弧菌進(jìn)入棘阿米巴原蟲滋養(yǎng)體體內(nèi)。共培養(yǎng)24hr,霍亂弧菌在棘阿米巴滋養(yǎng)體體內(nèi)增多。電鏡下,霍亂弧菌主要存在于棘阿米巴滋養(yǎng)體吞噬體空泡內(nèi),隨著滋養(yǎng)體包囊化,霍亂弧菌主要分布于包囊胞漿吞噬空泡內(nèi)、雙層細(xì)胞壁之間以及胞膜周圍。此外,還可在棘阿米巴內(nèi)側(cè)細(xì)胞壁與胞膜之間觀察到古典型霍亂弧菌。在棘阿米巴滋養(yǎng)體吞噬空泡內(nèi)可觀察到處于二分裂形態(tài)的霍亂弧菌,提示霍亂弧菌能在棘阿米巴滋養(yǎng)體內(nèi)進(jìn)行分裂繁殖。包囊傳代實(shí)驗(yàn)表明,霍亂弧菌能在包囊在分化成滋養(yǎng)體的過程中釋放出胞外。因此,阿米巴原蟲滋養(yǎng)體可成為霍亂弧菌增殖的孵化器,而阿米巴原蟲包囊為霍亂弧菌環(huán)境生存提供了條件。 在4℃水環(huán)境中,與棘阿米巴原蟲共培養(yǎng)的埃爾托霍亂弧菌的活菌數(shù)在30d內(nèi)由感染前的(3.32±0.43)×109 cfu/ml降低為1 cfu/ml,而對照組到45d時(shí)才下降到1 cfu/ml。但與埃爾托霍亂弧菌共培養(yǎng)50d的棘阿米巴包囊可經(jīng)包囊傳代再檢測出埃爾托霍亂弧菌。在28℃條件下,棘阿米巴的存在可使埃爾托霍亂弧菌在水環(huán)境中維持較高的濃度。隔離試驗(yàn)結(jié)果表明,棘阿米巴原蟲分泌或代謝所產(chǎn)生的物質(zhì)可能有利于霍亂弧菌的生存。棘阿米巴包囊提高了埃爾托霍亂弧菌在低溫水環(huán)境中的生存能力,但模擬環(huán)境下尚不足以保護(hù)其在低溫下長期生存。 為確定環(huán)境中霍亂弧菌與FLA原蟲兩者之間的關(guān)系,我們在黃浦江水域中分離得到一株非O1群(非O139群)霍亂弧菌,并在同一水域的河水和河岸土壤中各分離到的1株自由生活阿米巴原蟲。以自由生活阿米巴18S rRNA通用引物PCR檢測陽性,特異性引物檢測結(jié)果顯示均為棘阿米巴屬。將序列在Clone Manager軟件中與參照序列進(jìn)行多重比對,分離自黃浦江水域的棘阿米巴W-HPR和E-HPR的基因型均為T4型。將分離自同一水域的非O1群霍亂弧菌分離株與W-HPR棘阿米巴在28℃共培養(yǎng)8h后,非O1群霍亂弧菌進(jìn)入棘阿米巴原蟲滋養(yǎng)體體內(nèi)。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長,霍亂弧菌在W-HPR滋養(yǎng)體體內(nèi)逐漸增多。因此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果間接反映出黃浦江水域中非O1群霍亂弧菌分離株與棘阿米巴原蟲之間可存在共生關(guān)系。 為探討消毒劑對棘阿米巴原蟲及其胞內(nèi)霍亂弧菌的殺滅作用,采用不同濃度有效氯含量的漂粉精進(jìn)行消毒試驗(yàn)。漂粉精消毒模擬水樣作用30min能殺滅棘阿米巴滋養(yǎng)體和包囊的最低有效劑量分別為50mg/L和125mg/L。8份上海居民飲用水中的4份水樣經(jīng)NNA平板培養(yǎng)可觀察到FLA原蟲。含有效氯濃度為2mg/L的漂粉精消毒劑在殺滅埃爾托霍亂弧菌時(shí),棘阿米巴原蟲能對埃爾托霍亂弧菌在抵抗消毒劑作用時(shí)起到一定的保護(hù)作用。 綜上可見,霍亂弧菌在適應(yīng)棘阿米巴原蟲環(huán)境后,能利用原蟲所提供的養(yǎng)料進(jìn)行分裂、增殖、生長,兩者屬于共生關(guān)系。在常溫下,棘阿米巴的存在可使埃爾托霍亂弧菌在水環(huán)境中維持較高的濃度；而在低溫水環(huán)境中,雖然棘阿米巴包囊能提高埃亂弧菌的生存能力,但模擬環(huán)境下尚不足以保護(hù)其在低溫下長期生存。同時(shí),棘阿米巴原蟲能對埃爾托霍亂弧菌在抵抗含有效氯濃度為2-15mg/L的漂粉精消毒劑作用時(shí)起到一定的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378.3;R382

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2474889