【摘要】： 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是一種威脅人類健康的重要病毒。目前,尚缺乏特異、有效的治療措施,故探索新型抗HCV的治療方法具有重要意義。本課題選擇HCV基因組中序列相對(duì)保守、且在病毒復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用的核心基因(core gene,C)作為靶基因,針對(duì)該基因mRNA中四個(gè)潛在切割位點(diǎn)(第52、167、347、438位),在大腸桿菌RNase P催化亞基(M1 RNA)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了相應(yīng)的四個(gè)特異性M1GS核酶。 通過(guò)胞外切割試驗(yàn)對(duì)所構(gòu)建的M1GS核酶的靶向切割活性進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)針對(duì)第167位點(diǎn)的M1GS核酶能對(duì)HCV核心基因的mRNA進(jìn)行靶向切割,產(chǎn)生167nt和420nt大小的切割產(chǎn)物片段;而針對(duì)其他三個(gè)位點(diǎn)的M1GS核酶的靶向切割活性則并不明顯。 進(jìn)一步將針對(duì)第167位的M1GS核酶基因克隆至真核表達(dá)載體(pcDNA3.1)中,構(gòu)建M1GS核酶真核表達(dá)性重組質(zhì)粒(pcDNA-M1GS2);并與另外所構(gòu)建的HCV核心基因真核表達(dá)性重組質(zhì)粒(pcDNA-HCV/core)共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,以探討胞外初篩有效的M1GS核酶能否在胞內(nèi)抑制靶基因的表達(dá)。通過(guò)半定量的RT-PCR和westen blot,結(jié)果表明該M1GS核酶在胞內(nèi)不僅可使靶基因mRNA的水平明顯降低,而且可大大降低HCV核心蛋白的表達(dá)量。 總之,通過(guò)本課題的研究,我們成功獲得一種可在胞內(nèi)、外對(duì)HCV核心基因mRNA進(jìn)行靶向切割的M1GS核酶,從而為今后更進(jìn)一步的研究(如胞內(nèi)抗HCV感染、體內(nèi)抗HCV感染等)提供直接的實(shí)驗(yàn)材料,也為M1GS這種新型核酶技術(shù)用于抗HCV治療的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Hepatitis C virus (Hepatitis C virus,HCV) is an important virus that threatens human health. At present, there is still lack of specific and effective treatment measures, so it is of great significance to explore new anti-HCV treatment methods. In this study, the core gene (core gene,C), which is relatively conserved in the genome of HCV and plays a key role in viral replication, was selected as the target gene to target four potential cleavage sites (position 52167347438) of the gene mRNA. Based on E. coli RNase P catalytic subunit (M1 RNA), four specific M1GS ribozymes were constructed. The target cleavage activity of the constructed M1GS ribozyme was studied by extracellular cleavage assay. The results showed that the M1GS ribozyme at position 167 could target the mRNA of the HCV core gene and produce the fragments of 167nt and 420nt. The target cleavage activity of M1GS ribozyme targeting the other three sites was not obvious. The 167th M1GS ribozyme gene was further cloned into the eukaryotic expression vector (pcDNA3.1) to construct the eukaryotic expression recombinant plasmid (pcDNA-M1GS2) of M1GS ribozyme. The recombinant eukaryotic expression plasmid (pcDNA-HCV/core) of HCV core gene was co-transfected into HeLa cells to investigate whether the effective M1GS ribozyme could inhibit the expression of target gene in the cells. The results of semi-quantitative RT-PCR and westen blot, showed that the M1GS ribozyme not only reduced the level of target gene mRNA, but also decreased the expression of HCV core protein. In conclusion, through the study of this subject, we have successfully obtained a M1GS ribozyme that can target mRNA, the core gene of HCV, both inside and outside of the cell, so as to provide further research (such as intracellular anti-HCV infection) in the future. In vivo anti-HCV infection (anti-HCV infection, etc.) provides direct experimental materials, but also provides a solid foundation for the research of M1GS, a new ribozyme technique, for anti-HCV therapy.
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2467180