【摘要】： 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是一種威脅人類健康的重要病毒。目前,尚缺乏特異、有效的治療措施,故探索新型抗HCV的治療方法具有重要意義。本課題選擇HCV基因組中序列相對保守、且在病毒復制過程中起關鍵作用的核心基因(core gene,C)作為靶基因,針對該基因mRNA中四個潛在切割位點(第52、167、347、438位),在大腸桿菌RNase P催化亞基(M1 RNA)的基礎上,構建了相應的四個特異性M1GS核酶。 通過胞外切割試驗對所構建的M1GS核酶的靶向切割活性進行研究,結果發(fā)現(xiàn)針對第167位點的M1GS核酶能對HCV核心基因的mRNA進行靶向切割,產(chǎn)生167nt和420nt大小的切割產(chǎn)物片段;而針對其他三個位點的M1GS核酶的靶向切割活性則并不明顯。 進一步將針對第167位的M1GS核酶基因克隆至真核表達載體(pcDNA3.1)中,構建M1GS核酶真核表達性重組質(zhì)粒(pcDNA-M1GS2);并與另外所構建的HCV核心基因真核表達性重組質(zhì)粒(pcDNA-HCV/core)共轉(zhuǎn)染HeLa細胞,以探討胞外初篩有效的M1GS核酶能否在胞內(nèi)抑制靶基因的表達。通過半定量的RT-PCR和westen blot,結果表明該M1GS核酶在胞內(nèi)不僅可使靶基因mRNA的水平明顯降低,而且可大大降低HCV核心蛋白的表達量。 總之,通過本課題的研究,我們成功獲得一種可在胞內(nèi)、外對HCV核心基因mRNA進行靶向切割的M1GS核酶,從而為今后更進一步的研究(如胞內(nèi)抗HCV感染、體內(nèi)抗HCV感染等)提供直接的實驗材料,也為M1GS這種新型核酶技術用于抗HCV治療的研究奠定了堅實基礎。
[Abstract]:Hepatitis C virus (Hepatitis C virus,HCV) is an important virus that threatens human health. At present, there is still lack of specific and effective treatment measures, so it is of great significance to explore new anti-HCV treatment methods. In this study, the core gene (core gene,C), which is relatively conserved in the genome of HCV and plays a key role in viral replication, was selected as the target gene to target four potential cleavage sites (position 52167347438) of the gene mRNA. Based on E. coli RNase P catalytic subunit (M1 RNA), four specific M1GS ribozymes were constructed. The target cleavage activity of the constructed M1GS ribozyme was studied by extracellular cleavage assay. The results showed that the M1GS ribozyme at position 167 could target the mRNA of the HCV core gene and produce the fragments of 167nt and 420nt. The target cleavage activity of M1GS ribozyme targeting the other three sites was not obvious. The 167th M1GS ribozyme gene was further cloned into the eukaryotic expression vector (pcDNA3.1) to construct the eukaryotic expression recombinant plasmid (pcDNA-M1GS2) of M1GS ribozyme. The recombinant eukaryotic expression plasmid (pcDNA-HCV/core) of HCV core gene was co-transfected into HeLa cells to investigate whether the effective M1GS ribozyme could inhibit the expression of target gene in the cells. The results of semi-quantitative RT-PCR and westen blot, showed that the M1GS ribozyme not only reduced the level of target gene mRNA, but also decreased the expression of HCV core protein. In conclusion, through the study of this subject, we have successfully obtained a M1GS ribozyme that can target mRNA, the core gene of HCV, both inside and outside of the cell, so as to provide further research (such as intracellular anti-HCV infection) in the future. In vivo anti-HCV infection (anti-HCV infection, etc.) provides direct experimental materials, but also provides a solid foundation for the research of M1GS, a new ribozyme technique, for anti-HCV therapy.
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R373

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