【摘要】： 自然殺傷T細胞(Nature killer T cell,NKT)是在T淋巴細胞發(fā)育早期中出現(xiàn)的特殊類型的T淋巴細胞亞群。既往研究發(fā)現(xiàn)NKT細胞在機體微環(huán)境免疫調節(jié),腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病及多種皮膚科疾病的發(fā)生中具有重要作用。NKT細胞表現(xiàn)出T細胞和自然殺傷細胞(Nature killer cell,NK)的特性,在功能上NKT細胞具有T細胞免疫調節(jié)功能,同時又兼具NK細胞的自然殺傷作用。NKT細胞是溝通天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁,但對于NKT細胞發(fā)育成熟的調控機制的認識尚不清晰。 microRNA是新發(fā)現(xiàn)的一類內源性的短鏈編碼單鏈RNA分子,長度約22堿基(nt),可以通過與靶基因特異性相互作用在轉錄后水平對靶mRNA進行降解、翻譯抑制發(fā)揮著重要的生物學作用。microRNA參與免疫細胞的產生,發(fā)育和分化,并影響免疫細胞的功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),敲除小鼠造血干細胞系Dicer裂解酶,造成小鼠造血系統(tǒng)缺乏成熟microRNAs,繼而發(fā)現(xiàn)胸腺細胞中NKT細胞的發(fā)育和成熟明顯受到抑制,但傳統(tǒng)T細胞不受明顯影響。目前關于microRNA在NKT細胞發(fā)育中作用的研究甚少,尚無單個microRNA對NKT細胞發(fā)育的相關研究。 基于本課題組先前的研究基礎,為繼續(xù)深入探究單個microRNA在NKT細胞發(fā)育及功能的作用,課題組使用流式細胞分選儀分選不同發(fā)育階段NKT細胞,通過microarray技術分析在不同發(fā)育階段的NKT中microRNAs的表達變化,發(fā)現(xiàn)miR155和miR223特異性高表達于NKT細胞發(fā)育不成熟階段(階段1 CD44 lowNK1.1-和階段2 CD44highNK1.1-),而在成熟階段(階段3 CD44highNK1.1+)表達明顯降低。這些結果推測miR155和miR223可能對NKT細胞的發(fā)育成熟,并可能影響了細胞的功能,但目前缺乏確鑿的實驗證據(jù)。 研究目的與方法 為探究miR155和miR223在NKT細胞發(fā)育成熟和功能中的作用,本課題以miR223敲除(KO)小鼠,miR155敲除(KO)小鼠和造血干細胞特異性miR155轉基因(KI)小鼠為研究對象,觀察在特異性改變miR155及miR223表達水平的情況下,NKT細胞的發(fā)育成熟以及其功能是否出現(xiàn)異常變化。使用裝載了α-GalCer的CD1d四聚體(α-GalCer-CD1d tetramers)的特異性抗體標記NKT細胞,應用流式細胞儀檢測NKT細胞在不同淋巴器官中的數(shù)目,同時檢測NKT細胞成熟細胞標記物表達水平。分別使用α-GalCer體內注射或PMA/Ionomycin體外刺激NKT細胞,檢測NKT細胞分泌細胞因子的功能。 研究結果 1)在miR223KO小鼠模型中,NKT細胞發(fā)育成熟與功能的變化 研究結果顯示,與野生型(WT)小鼠相比,在miR223 -/Y KO小鼠中傳統(tǒng)型T細胞各細胞亞群的比率為發(fā)生明顯改變,miR223 -/Y KO小鼠與WT小鼠CD4+細胞亞群所占比率分別為10.56% vs.11.35%,CD8+細胞亞群5.02% vs. 5.71%,CD4+CD8+雙陽性占81.60% vs. 80.65%,CD4-CD8-雙陰性所占比率2.83% vs. 2.30%。胸腺、脾臟、肝臟、外周淋巴結及骨髓中NKT細胞的數(shù)目未發(fā)生明顯變化(胸腺:0.15±0.02% vs. 0.15±0.01%,P=0.805,脾臟:0.80±0.14% vs. 0.73±0.13%,P=0.715,肝臟:14.67±3.51% vs. 13.37±2.83%,P=0.764,外周淋巴結:0.12±0.05% vs. 0.14±0.03%, P=0.557,骨髓:0.99±0.44% vs. 1.71±0.58%, P=0.376)。 在NKT細胞三個發(fā)育成熟階段中,包括階段1 CD44lowNK1.1-、階段2 CD44highNK1.1-及階段3 CD44highNK1.1+,WT小鼠中胸腺NKT細胞與miR223 -/Y敲除小鼠相比,在三個發(fā)育階段各占的比率在階段1為5..59±0.92% vs.6.57±2.32%,P=0.781,在階段2分別為15.59±4.44% vs. 13.08±2.39%,P=0.593,在階段3的NKT細胞分別為77.83±4.69% vs. 78.71±3.85%,P=0.894。;NKT細胞成熟細胞表面標記物(包括Ly49G2,CD69,CD24及CD122)的表達均無明顯異常。在外周淋巴器官中也觀察到了同樣的結果,NKT細胞中NK1.1+的比率無明顯差異。 經α-GalCer體內注射以及PMA/Ionomycin體外刺激NKT細胞,miR223 -/Y敲除小鼠NKT細胞分泌細胞因子(IL-4、IFN-γ)與野生型小鼠相比未發(fā)現(xiàn)明顯異常。 2)在miR155KO小鼠模型中,NKT細胞發(fā)育成熟與功能的變化 在miR155敲除小鼠各個淋巴器官中NKT細胞數(shù)目不發(fā)生明顯變化,野生型小鼠與miR155KO小鼠相比,胸腺NKT細胞所占比率為0.32±0.02% vs. 0.30±0.04%,P=0.745。脾臟NKT細胞占B220陰性細胞的0.83±0.12% vs. 0.83±0.13%,P=0.987。肝臟NKT細胞占B220陰性細胞的17.19±2.35% vs. 11.63±1.26%,P=0.694。 miR155敲除小鼠胸腺中NKT細胞的發(fā)育正常,miR155敲除小鼠中胸腺NKT細胞在三個發(fā)育階段各占的比率與野生小鼠中胸腺NKT細胞相比無明顯差異。野生型(WT)小鼠microRNA155-/-小鼠在三個發(fā)育階段各占的比率在階段1分別為12.94±2.90% vs.12.73±3.49%,P=0.965,在階段2分別為17.36±2.12% vs. 14.88±2.23%,P=0.439,在階段3的NKT細胞分別為63.53±6.54% vs. 64.94±6.75%,P=0.894。兩者之間無顯著差異。 NKT細胞成熟細胞表面標記物的表達均無明顯異常。在外周淋巴器官中NKT細胞的進一步成熟也未出現(xiàn)異常,NK1.1陽性NKT細胞的比率無明顯差異。 3)在造血干細胞特異性miR155KI小鼠中,NKT細胞發(fā)育成熟與功能的變化 與WT小鼠相比,miR155KI小鼠胸腺、脾臟、肝臟、外周淋巴結及骨髓中NKT細胞的數(shù)目未發(fā)生明顯變化。野生型小鼠與miR155KI小鼠相比,胸腺NKT細胞所占比率為0.17±0.04% vs. 0.20±0.04%,P=0.616。脾臟NKT細胞占B220陰性細胞的0.85±0.14% vs. 0.66±0.10%,P=0.314。肝臟NKT細胞占B220陰性細胞的18.70±4.53% vs. 15.31±2.08%,P=0.522。淋巴結中NKT細胞占B220陰性細胞的0.16±0.03% vs. 0.19±0.02%,P=0.464。在各個淋巴器官中,NKT細胞的比率未發(fā)現(xiàn)存在明顯統(tǒng)計學差異。 在miR155KI小鼠胸腺內NKT細胞發(fā)育阻滯在階段2即CD44highNK1.1-階段,缺少成熟NKT細胞。野生型小鼠與miR155KI小鼠胸腺NKT細胞在三個發(fā)育階段1分別為6.56±1.29% vs.13.01±2.91%,P=0.077,在階段2分別為21.43±6.65% vs. 63.82±5.10%,P0.001,在階段3的NKT細胞分別為69.03±9.37% vs. 15.93±2.59%,P0.001。與野生型小鼠相比,在miR155KI小鼠胸腺內NKT細胞發(fā)育阻滯在階段2即CD44highNK1.1-階段,缺少成熟NKT細胞,NKT細胞發(fā)育成熟明顯滯后。 miR155KI小鼠的胸腺中NKT細胞成熟細胞標記物表達水平降低。NKT細胞表達分子CD122、CD6、LY49C陽性比率分別為15.69±4.12%、26.25±3.87%、4.43±1.45%,均分別低于WT小鼠(71.59±5.03%、64.42±4.07%,38.03±3.44%),統(tǒng)計學差異顯著(P0.0001)。miR155KI小鼠的在外周淋巴器官中NKT細胞中表面成熟標記NK1.1的表達均顯著低于同窩的野生型小鼠,NKT細胞的成熟也明顯阻滯。在4~6周齡miR155KI小鼠中NKT細胞的增殖和凋亡比率均顯著增加。 經α-GalCer體內注射后,與野生型小鼠相比,miR155小鼠NKT細胞分泌的細胞內因子IL-4(34.73% vs. 9.09%)及IFN-γ(47.94% vs. 16.51%)水平明顯降低;但經PMA/Ionomycin體外刺激NKT細胞,可以可恢復NKT細胞分泌IL4的水平(60.00% vs. 55.55%);miR155KI小鼠IFN-γ水平顯著降低(70.00% vs. 39.00%)。 研究結論: 1)miR223的缺失不影響NKT細胞在胸腺及外周淋巴器官的發(fā)育成熟,同時NKT細胞的功能不受明顯影響。 2)miR155的缺失也不影響NKT細胞的發(fā)育成及功能。 3)miR155的增加會顯著影響NKT細胞發(fā)育,導致成熟明顯滯后。并且可以顯著降低NKT的功能及其細胞因子的分泌表達,分泌軸偏向Th2類細胞因子。 基于目前我們的研究結果,miR155和miR223的缺失并不會影響NKT細胞在胸腺內的發(fā)育成熟,也不影響NKT細胞在外周淋巴器官的發(fā)育,同時NKT細胞的功能不受明顯影響。但并不表示miR155和miR223不具有調節(jié)NKT細胞發(fā)育成熟的功能。miR155在NKT細胞成熟階段的表達迅速降低,這是NKT細胞發(fā)育成熟所必須的過程。如在NKT細胞發(fā)育過程中miR155的表達未能降低,其靶基因表達無法正常表達,會明顯影響NKT細胞的成熟及具備功能。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【共引文獻】

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1 宗金寶,張建;NK細胞與皮膚病[J];中國麻風皮膚病雜志;2005年03期

2 沈宏;唐旭;王一玲;許愛娥;;T細胞、角蛋白10、Ki-67在進展期銀屑病皮損和皮損邊緣皮膚的表達和意義[J];中國麻風皮膚病雜志;2007年03期

3 鄭昭t，

本文編號：2466418