【摘要】： 母-胎界面滋養(yǎng)細胞具有獨特的類似于腫瘤細胞的生物學行為,即高增殖和侵襲能力。滋養(yǎng)細胞增殖與侵襲對于囊胚植入、胎盤發(fā)育,并建立恰當?shù)哪?胎關系至關重要。滋養(yǎng)細胞增殖與侵襲功能障礙是子癇前期、胎兒宮內(nèi)生長受限(FGR)、自然流產(chǎn)等妊娠相關疾病的主要原因。但在正常妊娠,滋養(yǎng)細胞很少發(fā)生無限制增殖和遠處轉移,提示可能受到細胞間直接或間接的分子調(diào)控,使其促侵襲和抑制侵襲維持生理性動態(tài)平衡。母-胎界面微環(huán)境細胞與分子間的相互作用可以調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞侵入子宮內(nèi)膜及蛻膜。因此,母-胎界面參與調(diào)控滋養(yǎng)細胞侵襲力的關聯(lián)分子,可以影響胚泡的正常植入和生長。 CD82蛋白是一種廣泛表達的Tetraspanin超家族跨膜糖蛋白,是經(jīng)典的腫瘤細胞侵襲抑制基因。已有研究證實CD82是細胞遷移的一個重要調(diào)節(jié)蛋白,CD82低表達與腫瘤細胞的侵襲和轉移相關,致使多種晚期惡性腫瘤的不良預后。因此我們推測CD82可能參與母-胎界面滋養(yǎng)細胞侵襲能力的調(diào)控；解析CD82在母-胎界面的作用機制,及解析調(diào)控CD82表達的相關蛋白和基因將有助于闡明生理狀態(tài)下胚泡植入和病理性滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)病機制,對治療滋養(yǎng)細胞疾病亦具有潛在的臨床應用價值。 本研究在前期工作基礎上,進一步關注CD82作用于人早孕期滋養(yǎng)細胞的分子機制,擬闡明CD82對滋養(yǎng)細胞功能調(diào)控的分子機制；CD82表達調(diào)控,及其在母-胎界面促進滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質(zhì)細胞交叉對話,調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞侵襲能力的分子機制。 目的分析CD82在正常和早期妊娠失敗母-胎界面的表達及其表達調(diào)控。 方法收集人早孕期正�；虿幻髟蜃匀涣鳟a(chǎn)的絨毛與蛻膜組織,應用本實驗室建立的胰酶消化、密度梯度離心法分離、培養(yǎng)正常人早孕期滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質(zhì)細胞(DSCs)。采用RT-PCR、定量real-time RT-PCR、免疫組織化學、免疫細胞化學和傳統(tǒng)免疫印跡雜交法,分別檢測母-胎界面CD82的表達,比較分析CD82在正常早孕與早期妊娠失敗母-胎界面的表達差異。對原代培養(yǎng)的蛻膜基質(zhì)細胞進行多種干預,包括妊娠相關激素和炎性介質(zhì),用in-cell Western檢測蛻膜基質(zhì)細胞CD82的表達。 結果原代蛻膜基質(zhì)細胞轉錄、翻譯CD82；而原代滋養(yǎng)細胞不轉錄和翻譯CD82。從mRNA和蛋白水平分析蛻膜組織中CD82的表達水平,發(fā)現(xiàn)正常早孕期蛻膜明顯低于早期妊娠失敗的蛻膜。生理濃度范圍hCG能下調(diào)蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82(以10kU/L濃度作用最佳)；單獨生理濃度孕激素和17β雌二醇對蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82無明顯調(diào)節(jié)作用；但孕激素可以協(xié)同hCG進一步下調(diào)蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82。LPS促進蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82; IL-1β中和性抗體能拮抗LPS對蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82的促進作用。 結論CD82在人早孕期母-胎界面蛻膜基質(zhì)細胞表達,明顯低于早期妊娠失敗蛻膜,提示母-胎界面CD82異常表達可導致妊娠失敗。hCG下調(diào)蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82,提示CD82與正常妊娠有關,并可能參與控制滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生、發(fā)展；LPS通過刺激炎性介質(zhì)IL-1β的分泌,上調(diào)CD82的表達,提示CD82可介導炎癥導致的自然流產(chǎn)。 目的解析CD82在人早孕期母-胎界面的生物學功能。 方法原代培養(yǎng)人早孕期蛻膜基質(zhì)細胞和滋養(yǎng)細胞,利用siRNA干擾技術,成功沉默蛻膜基質(zhì)細胞CD82的表達,并建立直接或間接共培養(yǎng)體系；利用質(zhì)粒pCNA3.1(+)-CD82轉染滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系BeWo,成功實現(xiàn)BeWo細胞過表達CD82。蛻膜基質(zhì)細胞經(jīng)沉默CD82后,與原代滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng),此后采用Matrigel侵襲試驗分析滋養(yǎng)細胞的侵襲力。分析BeWo細胞經(jīng)轉染CD82后的侵襲力；分別用定量real-time RT-PCR、in-cell Western和免疫熒光法分析蛻膜基質(zhì)細胞沉默CD82后,及BeWo細胞過表達CD82后,侵襲相關分子的mRNA和蛋白表達水平。 結果蛻膜基質(zhì)細胞經(jīng)CD82沉默后,與原代滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng),使滋養(yǎng)細胞侵襲力明顯增強；蛻膜基質(zhì)細胞表達TIMP1明顯下調(diào),integrinβ1和integrinavP3表達明顯上調(diào)；而MMP2、MMP9、TIMP2和titin表達無明顯改變。相反,轉染CD82的BeWo細胞侵襲力明顯減弱,TIMP1表達明顯上調(diào),integrinβ1和integrinαvβ3表達明顯下調(diào)；同樣,MMP2、MMP9、TIMP2和titin表達無明顯差異。 結論蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82或滋養(yǎng)細胞過表達CD82均可控制滋養(yǎng)細胞的侵襲力,通過升調(diào)節(jié)TIMP1表達,實現(xiàn)滋養(yǎng)細胞與蛻膜基質(zhì)細胞的交叉對話。 目的探討CD82調(diào)節(jié)人滋養(yǎng)細胞侵襲性的信號通路。 方法應用siRNA轉染蛻膜基質(zhì)細胞沉默CD82的表達；質(zhì)粒轉染BeWo細胞過表達CD82,然后分析沉默及過表達CD82對侵襲相關的關鍵信號通路分子表達的調(diào)控作用。為了分析CD82抑制滋養(yǎng)細胞侵襲能性的信號通路,建立蛻膜基質(zhì)細胞和原代滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)體系,及BeWo細胞單獨培養(yǎng)體系,分別加入integrinβ1中和性抗體或MAPK/ERK信號通路阻斷劑U0126,用Matrigel侵襲試驗分析各組滋養(yǎng)細胞的侵襲力,以解析integrinβ1和MAPK/ERK1/2信號通路在CD82調(diào)節(jié)人早孕期滋養(yǎng)細胞侵襲中的作用；繼而用in-cell Western分析各組TIMP1蛋白表達水平。 結果在蛻膜基質(zhì)細胞與原代滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中,蛻膜基質(zhì)細胞經(jīng)沉默CD82后,使滋養(yǎng)細胞侵襲力明顯增加,pERK1/2與總ERK1/2的比值明顯升高,integrinβ1表達明顯增加,TIMP1表達明顯下降；而integrinβ1中和性抗體和U0126則明顯降低滋養(yǎng)細胞的侵襲力,能逆轉CD82沉默對滋養(yǎng)細胞侵襲力的增強作用,解除對磷酸化ERK1/2的升調(diào)節(jié)作用,提示蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82通過抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信號通路,控制人早孕期滋養(yǎng)細胞侵襲。integrinβ1中和性抗體和U0126處理也能有效逆轉CD82對TIMP1表達的升調(diào)作用。同樣,轉染CD82的BeWo細胞經(jīng)integrinβ1中和性抗體和U0126處理也呈現(xiàn)類似效果。TIMP1的表達水平與滋養(yǎng)細胞細胞的侵襲力呈直線負相關。 結論因此,CD82主要通過抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信號通路,促進人早孕期蛻膜基質(zhì)細胞表達TIMP1,上調(diào)的TIMP1依次抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲能力。 目的分析人早孕期母-胎界面SDF-1/CXCR4對CD82表達調(diào)節(jié)作用。 方法收集人早孕期正常蛻膜和絨毛組織,對原代蛻膜基質(zhì)細胞進行多種干預,包括原代滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清、重組人SDF-1、重組人CCL2、抗人SDF-1、CXCR4、CCL2中和性抗體或CCR2拮抗劑。用in-cell Western檢測蛻膜基質(zhì)細胞CD82的表達。同時建立蛻膜基質(zhì)細胞和原代滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)體系,同時引入抗人CXCR4中和性抗體,Matrigel侵襲試驗分析共培養(yǎng)體系滋養(yǎng)細胞的侵襲力。 結果滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清促進蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82；重組人SDF-1亦促進蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82; SDF-1或CXCR4中和性抗體可抑制滋養(yǎng)細胞上清對蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82的升調(diào)節(jié)作用。CXCR4中和性抗體直接處理滋養(yǎng)細胞明顯降低其侵襲力；但CXCR4中和性抗體預處理蛻膜基質(zhì)細胞后,共培養(yǎng)體系中滋養(yǎng)細胞的侵襲力明顯增加；CXCR4中和性抗體分別預處理滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質(zhì)細胞后,共培養(yǎng)體系的滋養(yǎng)細胞侵襲力降低。此外,CXCR4中和性抗體預處理蛻膜基質(zhì)細胞可以解除CD82對滋養(yǎng)細胞侵襲力的抑制作用。 結論人早孕期母-胎界面滋養(yǎng)細胞分泌SDF-1,通過白分泌方式促進自身侵襲；通過旁分泌升調(diào)節(jié)蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82,控制滋養(yǎng)細胞的過度侵襲,使其侵襲力維持在正常適度范圍,借此介導母-胎界面滋養(yǎng)細胞與蛻膜基質(zhì)細胞的交叉對話。 目的分析CsA調(diào)控母-胎界面CD82表達和滋養(yǎng)細胞侵襲力的分子機制。 方法收集人早孕期正常蛻膜和絨毛組織,用CsA處理原代蛻膜基質(zhì)細胞,或滋養(yǎng)細胞經(jīng)CsA預處理后收獲培養(yǎng)上清；用抗人SDF-1或CXCR4中和性抗體處理蛻膜基質(zhì)細胞,然后用in-cell Western檢測蛻膜基質(zhì)細胞CD82的表達。于滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質(zhì)細胞的單獨和共培養(yǎng)體系加入CsA, ELISA法分析培養(yǎng)上清中SDF-1的分泌；用抗人CXCR4中和性抗體分別預處理蛻膜基質(zhì)細胞和/或滋養(yǎng)細胞后,然后進行共培養(yǎng),在加入CsA后,Matrigel侵襲試驗分析共培養(yǎng)體系滋養(yǎng)細胞的侵襲力。 結果CsA對蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82無直接調(diào)節(jié)作用；但CsA能加強滋養(yǎng)細胞上清對蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82的促進作用；低濃度CsA能促進滋養(yǎng)細胞和共培養(yǎng)體系SDF-1的分泌；抗人SDF-1或CXCR4中和性抗體能抑制CsA通過滋養(yǎng)細胞對蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82的間接促進作用。在加入CsA的共培養(yǎng)體系中,抗人CXCR4中和性抗體預處理蛻膜基質(zhì)細胞可以部分逆轉CD82對滋養(yǎng)細胞侵襲力的抑制作用。 結論CsA促進滋養(yǎng)細胞分泌SDF-1,放大人早孕期母-胎界面滋養(yǎng)細胞對蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82的促進作用；CD82進而抑制滋養(yǎng)細胞侵襲能力。因此,CsA可協(xié)調(diào)母-胎界面滋養(yǎng)細胞與蛻膜基質(zhì)細胞之間的交叉對話。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)CD82對人早孕期母-胎界面具有多重調(diào)節(jié)作用：(1)通過抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信號通路促進TIMP1表達,抑制滋養(yǎng)細胞侵襲；(2)蛻膜基質(zhì)細胞通過表達CD82,控制滋養(yǎng)細胞過度侵襲；(3)蛻膜基質(zhì)細胞CD82過表達可導致早期妊娠失敗；(4)滋養(yǎng)細胞通過分泌SDF-1促進蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82,促進人早孕期母-胎界面滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質(zhì)細胞之間的交叉對話,適度控制滋養(yǎng)細胞侵襲能力；(5)CsA通過促進滋養(yǎng)細胞分泌SDF-1,升調(diào)節(jié)蛻膜基質(zhì)細胞表達CD82,參與滋養(yǎng)細胞侵襲能力的精密調(diào)控。此外,人早孕期母胎界面CD82的表達還受妊娠相關激素的調(diào)控。本研究為完善滋養(yǎng)細胞侵襲調(diào)控機制,及臨床治療反復自然流產(chǎn)等相關妊娠疾病提供了新策略與新思路。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R321

【參考文獻】

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本文編號：2461423