【摘要】： 目的 建立體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴增DA(Dark Agouti)大鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞的方法;建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反應(yīng)模型,用hIL-10基因修飾大鼠骨髓來源的不成熟樹突狀細(xì)胞(imDC);探討其誘導(dǎo)同種異體大鼠原位肝移植免疫耐受的情況。 方法 1.培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴增DA大鼠骨髓來源的DC,經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫表型及功能鑒定后,將pIRES2-EGFP- hIL-10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染imDC,檢測hIL-10在imDC中的表達。 2.建立改良的大鼠原位肝移植模型和DA大鼠→Lewis大鼠急性排斥反應(yīng)模型:在原二袖套法的基礎(chǔ)上,采用快速切取供肝,一針法連續(xù)縫合肝上下腔靜脈以及對出血點進行熱止血等方法,進行120例大鼠原位肝移植,并觀察術(shù)后存活率。 3.行以DA大鼠為供體、近交系Lewis大鼠為受體的同種異體原位肝移植100例,隨機均分為5組:未注射DC組(對照組)、mDC組、imDC組、空載體組、及hIL-10轉(zhuǎn)染組;分別于移植前5d每天給Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空載體轉(zhuǎn)染的imDC和hIL-10修飾的imDC各2×106個,于肝移植術(shù)后3d、7d、10d各處死4只,觀察外周血肝功能變化(ALT和TBIL),肝臟病理改變,外周血清細(xì)胞因子情況,各組除去技術(shù)死亡的受鼠,將余下受鼠作生存分析,死亡時取肝臟行病理組織學(xué)檢查。 結(jié)果 1.成功建立了體外大量培養(yǎng)、誘導(dǎo)及擴增大鼠骨髓來源DC的方法;經(jīng)倒置相差顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡及流式細(xì)胞儀鑒定,證實所培養(yǎng)細(xì)胞為DC。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示:DC形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞核大而偏位,細(xì)胞表面可見細(xì)長樹枝狀突起。免疫表型結(jié)果顯示:mDC和imDC表面均表達表面分子OX62,而共刺激分子CD86在mDC呈高表達,在imDC呈低表達。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)結(jié)果顯示:imDC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的能力明顯弱于mDC(P=0.005)。pIRES2-EGFP- hIL-10質(zhì)粒經(jīng)基因測序顯示其序列與Pubmed基因庫的hIL-10序列相符合;經(jīng)PCR鑒定示在540bp處有明顯的條帶。熒光顯微鏡觀察顯示pIRES2-EGFP- hIL-10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染imDC后可見黃綠色熒光。流式細(xì)胞術(shù)顯示轉(zhuǎn)染后DC表面分子CD86和CD80的表達未受影響。轉(zhuǎn)染后MLR顯示,hIL-10轉(zhuǎn)染組的imDC對T細(xì)胞的增殖反應(yīng)均弱于imDC組和空載體組(P=0.024和P=0.033)。ELISA檢測IL-10組的hIL-10表達明顯高于mDC組、imDC組及空載體組(P=0.004、0.004及0.003);經(jīng)Westen-Blot檢測有hIL-10蛋白表達。2.成功建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反應(yīng)模型。3.活體觀察:移植后的肝臟病理組織學(xué)切片顯示IL-10組術(shù)后僅有較少量的單核細(xì)胞浸潤,RAI評分2～5分,屬非確定型急性排斥反應(yīng)到輕度急性排斥反應(yīng),10d開始出現(xiàn)肝細(xì)胞再生,有少量的中性粒細(xì)胞浸潤。肝功能示IL-10組在7d、10d時,肝功能有所恢復(fù),但與imDC組及空載體組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ELISA檢測示,術(shù)后7d,IL-10組的血清IL-12濃度均低于對照組、mDC組、imDC組及空載體組(P為0.000、0.000、0.005及0.008)。IL-10組中位生存期40d均長于imDC組(23d)和空載體組(25d)(P均為0.002)。 結(jié)論 1.本實驗通過運用大鼠淋巴細(xì)胞分離液和培養(yǎng)過程的手法篩選相結(jié)合,能培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴增大量的DC;hIL-10基因轉(zhuǎn)染imDC能夠獲得有效的表達,轉(zhuǎn)染后對imDC表型沒有明顯影響;hIL-10基因轉(zhuǎn)染可明顯降低imDC對同種異體T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。 2.經(jīng)改良的大鼠原位肝移植方法,手術(shù)時間短,成功率高,穩(wěn)定可靠,建立了比較穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型,可滿足本實驗的要求。 3.hIL-10基因修飾的imDC能誘導(dǎo)同種異體大鼠肝移植免疫耐受,顯著延長同種異體肝移植大鼠的生存期。
[Abstract]:Purpose Establishment of a method of in vitro culture, induction and amplification of dendritic cells from a rat bone marrow source of a DA (Dark Agouti); an improved rat orthotopic liver transplantation model and an acute rejection response model, immature dendritic cells derived from bone marrow derived from the hIL-10 gene modified rat (imD C). To explore the immune tolerance of orthotopic liver transplantation induced by allogenic rats. case Methods 1. To culture, induce and amplify the DC of the bone marrow of the DA rats, the pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid was transfected imDC, and the hIL-10 was detected by transfecting the pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid after the morphological, immunological and functional identification. 2. Establishment of an improved rat orthotopic liver transplantation model and a model of acute rejection in the rat Lewis rats of DA rats: on the basis of the original two-cuff method, the liver and the upper and lower vena cava and the pair of upper and lower vena cava are continuously sewn by a needle method. The in-situ liver of 120 rats was performed by means of thermal hemostasis and the like. After transplantation, the survival rate was observed.3. In the case of donor and inbred Lewis rats,100 cases of orthotopic liver transplantation were randomly divided into 5 groups: no DC group (control group), mDC group, imDC group, empty vector group and hIL-10 transfection group. Lewis rats were given to Lewis on 5 days before transplantation. The imDC and hIL-10 modified imDC and hIL-10 modified imDC were injected into the rats for 3 days,7 days and 10 days after the liver transplantation. The changes of liver function in peripheral blood (ALT and TBIL), the pathological changes of the liver and the cytokines of peripheral blood were observed. In the case, the rats in each group were killed and the rest of the mice were analyzed for survival. death The results were as follows:1. A large number of methods for culturing, inducing and amplifying the bone marrow derived DC in the rat were successfully established. The results showed that the DC morphology of the cultured cells was irregular and fine. The results of the immunophenotyping show that both mDC and imDC surface express surface molecule OX62, while the co-stimulatory molecule CD The results of the mixed lymphocyte reaction (MLR) showed that the ability of imDC to stimulate the allogeneic T-lymphocytes was significantly weaker than that of mDC (P = 0.005). The pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid was sequenced by gene sequencing to be consistent with the hIL-10 sequence of the Pubmed gene bank. The pIRES2-EGFP-hI was observed by fluorescence microscope. L-10 plasmid was transfected with imDC, and then the yellow green fluorescence was observed. The expression of CD86 and CD80 was not affected by the expression of CD86 and CD80. The expression of hIL-10 in the IL-10 group was significantly higher than that of the mDC group, the imDC group and the empty vector group (P = 0.004, 0.004 and 0.003). -Blot detected hIL-10 protein expression. 3. In-situ liver transplantation model and acute rejection reaction model of rats.3. In-life observation: the pathological sections of the liver after transplantation show only a small amount of mononuclear cell infiltration after the transplantation of the IL-10 group, and the RAI score is 2-5, which belongs to the non-deterministic acute rejection reaction to the mild acute rejection reaction, and 10d is on. The liver function of the IL-10 group was recovered at the time of 7 d and 10 days, but compared with that of the liver function. The serum IL-12 concentration in the IL-10 group was lower than that in the control group, the mDC group, the imDC group and the empty vector group (P = 0.00), compared with the control group, the mDC group, the imDC group and the empty vector group. 0, 0.000, 0.005 and 0.008). The median survival time of the IL-10 group was longer than that of the imDC group (23d). and empty Conclusion:1. In this experiment, a large number of DC, hIL-10 and imDC were transfected by using the combination of the method of separation and culture of the lymphocytes of the rat. can obtain effective expression, and has no obvious effect on imDC phenotype after transfection; hIL-10 group 2. The modified rat orthotopic liver transplantation method has the advantages of short operation time, high success rate and stable and reliable operation. And a stable rat orthotopic liver transplantation model is established to meet the requirements of the experiment.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392.4

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本文編號：2454647