【摘要】： 第一部分鈣敏感受體在肺動脈血管平滑肌上表達及功能 目的：(1)探討鈣敏感受體在肺動脈平滑肌組織與細胞上的表達、分布。(2)探討鈣敏感受體在高鈣誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞胞漿鈣離子濃度變化中的作用。 方法：用組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠肺動脈血管平滑肌細胞，用胰蛋白酶消化法進行細胞傳代培養(yǎng)。用鈣敏感受體特異性單克隆抗體，，采用免疫印跡、組織與細胞化學(xué)免疫熒光技術(shù)檢測鈣敏感受體在大鼠肺動脈血管平滑肌組織與細胞上的表達與分布。采用鈣熒光探針Fura-2／AM和顯微熒光成像系統(tǒng)檢測胞漿鈣離子濃度。 結(jié)果：(1)細胞的形態(tài)與平滑肌肌動蛋白α的特異性表達證實所培養(yǎng)的細胞為大鼠肺動脈平滑肌細胞。(2)特異性抗體檢測發(fā)現(xiàn)肺動脈血管平滑肌組織和細胞均有鈣敏感受體的表達，細胞膜與細胞漿均見其分布，且分子量不同，分別為55-72kD和170kD左右。(3)6 mM和7.5 mM[Ca~(2+)]_0分別使肺動脈平滑肌細胞胞漿鈣離子濃度從76.53±2.23 nM快速上升至238.78±7.26和382.74±9.87 nM(p＜0.01，N=23)，并維持在高位水平，形成一高平臺，細胞外液恢復(fù)到常鈣時，胞漿鈣離子濃度先迅速下降，然后緩慢下降，并形成一略高于基線的平臺；而4 mM[Ca~(2+)]_0引起胞漿鈣離子濃度的變化與基線水平無顯著差異(p＞0.05，N=23)。(4)鈣敏感受體抑制劑Calhex 231 1μM+6 mM或7.5 mM[Ca~(2+)]_0使肺動脈平滑肌細胞胞漿鈣離子濃度從75.54±6.48 nM分別上升至139.26±11.25 nM和198.89±18.39 nM(p＜0.01，N=21)；3μM Calhex 231+6mM或7.5 mM Ca~(2+)使胞漿鈣離子濃度從77.91±3.65 nM上升至99.15±6.18 nM和119.07±10.63 nM(p＜0.01，N=20)；而0.1μM Calhex 231對6 mM和7.5 mM[Ca~(2+)]_0所致鈣離子濃度變化無顯著影響(p＞0.05，N=23)。 結(jié)論：(1)肺動脈血管平滑肌組織與細胞均有對胞外鈣敏感的受體，細胞膜與細胞漿均見其分布。(2)鈣敏感受體抑制劑Calhex 231顯著抑制胞外高鈣所致肺動脈平滑肌細胞胞漿鈣離子濃度的升高，表明鈣敏感受體參與了細胞外高鈣引起肺動脈平滑肌細胞胞漿鈣離子濃度的升高。 第二部分新的細胞外鈣感受機制在缺氧引起肺動脈平滑肌細胞胞漿鈣離子濃度變化中的作用 目的：(1)證實缺氧對肺動脈平滑肌細胞胞漿鈣離子濃度及活性氧的變化。(2)探討鈣敏感受體在缺氧觸發(fā)肺動脈平滑肌細胞鈣信號變化中的作用。(3)確定缺氧時肺動脈平滑肌細胞活性氧變化與鈣敏感受體活化，胞漿鈣離子濃度變化之間的關(guān)系。 方法：向灌流液中充入氮氣復(fù)制細胞缺氧模型，采用鈣熒光探針Fura-2／AM、活性氧敏感探針H_2-DCFDA和顯微熒光成像系統(tǒng)檢測胞漿鈣離子濃度及活性氧含量的變化。運用RNAi技術(shù)特異性抑制CaR基因的表達，采用免疫印跡技術(shù)檢測干擾效率。 結(jié)果：(1)肺動脈平滑肌細胞經(jīng)三次間斷的低氧處理，胞漿鈣離子濃度從77.66±1.74 nM分別上升到161.13±11.25 nM、133.03±8.44 nM、109.94±4.64 nM，均顯著高于基線水平(p＜0.01，N=51)，且后一次缺氧產(chǎn)生的鈣離子濃度峰值均明顯小于前一次(p＜0.01)。(2)用低氧無鈣液灌流肺動脈平滑肌細胞，胞漿鈣離子濃度下降至69.65±3.59 nM，略低于基線水平(78.09±2 nM，N=43)，無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，但與有胞外鈣的單純?nèi)毖踅M(133.03±8.44 nM，N=51)相比，顯著降低(p＜0.01)。(3)實驗分為Blankcontrol、ShRNA control和ShRNA targeted三組，其[Ca~(2+)]_i基線水平分別為80.67±3.49nM(N=14)、79.3±4.17 nM(N=11)和80.53±4.3 nM(N=9)，各組之間無顯著差異(p＞0.05)。缺氧使ShRNA targeted組肺動脈平滑肌細胞[Ca~(2+)]_i上升至109.16±8.41 nM，比Blank control組(148.22±8.89 nM)和ShRNA control組(150.68±10.48 nM)顯著降低(p＜0.01)。100μM組胺刺激Blank control、ShRNA control及ShRNA targeted組肺動脈平滑肌細胞，使[Ca~(2+)]_i分別上升為222.21±15.33 nM、223.12±16.85 nM、224.48±18.76nM，各組之間無顯著差異(p＞0.05)。(4)缺氧(PO_2為14.3±2.5 mmHg)使肺動脈平滑肌細胞內(nèi)活性氧熒光絕對值從824.44±26.43上升到2590.66±97.37，平均升高至常氧的3.14±0.13倍(p＜0.01，N=22)，活性氧熒光值變化率[(處理后熒光值-處理前熒光值)／處理前熒光值×100％]為(214.23±10.58)％。(5)細胞外分別加入0.1、1、10、20、30、50和100μM H_2O_2模擬缺氧所致肺動脈平滑肌細胞活性氧的變化，得到一回歸曲線：y=0.064x+1.9023，R~2=0.9897[其中x為活性氧熒光值變化率(％)，y為過氧化氫濃度(μM)]，并計算出上述缺氧模型所致肺動脈平滑肌細胞活性氧濃度為(15.61±1.24)μM(N=22)。(6)用15.61μM H_2O_2處理Blank control、ShRNA control和ShRNA targeted三組肺動脈平滑肌細胞3分鐘，其[Ca~(2+)]_i分別上升至151.27±9.7nM(N=12)、149.83±10.05 nM(N=8)、105.7±7.83 nM(N=7)，其中ShRNA targeted組比Blank control和ShRNA control顯著降低(p＜0.01)。各組之間基線[Ca~(2+)]_i及100μM組胺所致的[Ca~(2+)]_i峰值無顯著差異(p＞0.05)。 結(jié)論：缺氧通過增加活性氧來活化CaR使其敏感性增高，在細胞外常鈣作用下被激活，引起肺動脈平滑肌細胞胞漿鈣離子濃度升高。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 胡清華，王迪潯;肺、腦動脈內(nèi)皮和平滑肌細胞急性缺氧時某些第二信使的變化[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;1998年01期

本文編號：2452083