發(fā)布時(shí)間：2019-03-31 15:27

【摘要】： 背景及目的 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是年齡相關(guān)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。因此,研究AD的發(fā)病機(jī)制,探索防治AD的干預(yù)靶點(diǎn),是神經(jīng)科學(xué)的工作重點(diǎn)。AD動(dòng)物模型是研究工作的重要工具。在對(duì)AD發(fā)病因素的研究過程中,發(fā)現(xiàn)β淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)在腦內(nèi)的沉積是AD發(fā)病的早期過程和中心環(huán)節(jié)。聚集態(tài)的Aβ發(fā)揮神經(jīng)毒性,啟動(dòng)了AD的病理進(jìn)程,包括膠質(zhì)細(xì)胞的廣泛活化、炎性微環(huán)境產(chǎn)生、神經(jīng)元功能紊亂及死亡等。Aβ的沉積活化腦內(nèi)具有吞噬活性的小膠質(zhì)細(xì)胞,引起先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)(innate immune response)。Aβ能否募集外周血免疫細(xì)胞穿過血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)向炎癥部位聚集,引起過繼性免疫應(yīng)答(adaptive immune response)尚不清楚。血腦屏障由微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和星型膠質(zhì)細(xì)胞的足突構(gòu)成,將腦實(shí)質(zhì)和血液分開,正常情況下免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和分子不能自由進(jìn)入腦。但是,隨著研究不斷進(jìn)展,人們逐漸認(rèn)識(shí)到,即使在生理狀態(tài)下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也存在免疫監(jiān)視過程。外周淋巴細(xì)胞可以主動(dòng)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì),啟動(dòng)腦內(nèi)的免疫應(yīng)答,清除可能會(huì)引起腦病變的因子。 淋巴細(xì)胞穿過血腦屏障是一個(gè)復(fù)雜的過程。淋巴細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的黏附分子及其受體的相互作用發(fā)揮了重要作用。本研究室陳譽(yù)華課題組在研究AD病人T細(xì)胞穿過血腦屏障機(jī)制的過程中,發(fā)現(xiàn)AD病人外周血T淋巴細(xì)胞穿過血腦屏障體外模型——人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的能力顯著增高;并且證實(shí)AD病人外周血T淋巴細(xì)胞高表達(dá)CXCR_2受體;CXCR_2受體是細(xì)胞因子受體家族的重要一員,與其配體IL-8相互作用能夠驅(qū)化淋巴細(xì)胞發(fā)生體內(nèi)外遷移。T淋巴細(xì)胞高表達(dá)CXCR_2受體促進(jìn)其穿越血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì),但是遷移入腦后的T淋巴細(xì)胞在AD病程發(fā)展的進(jìn)程中起到怎樣的作用尚未清楚�；诖�,在本研究中采用大鼠腦立體定向注射的方法,建立β淀粉樣蛋白在腦內(nèi)沉積的動(dòng)物模型,同時(shí)使用CXCR_2受體拮抗劑來阻斷T淋巴細(xì)胞遷移入腦,旨在研究入腦的T淋巴細(xì)胞在AD病變中的作用,同時(shí)分析T淋巴細(xì)胞進(jìn)入腦內(nèi)可能的機(jī)制。 方法 一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 1、采用大鼠腦立體定位注射技術(shù)將聚集態(tài)Aβ_(1-42)注入大鼠雙側(cè)海馬,腹腔注射CXCR_2受體的拮抗劑SB-332235-Z或者拮抗劑的溶劑peg-400,對(duì)照組注射等體積的Aβ_(42-1)。 2、利用免疫組織化學(xué)染色方法觀察阻斷T淋巴細(xì)胞入腦前后小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD_(11b)、MHC-Ⅱ變化。 3、利用免疫熒光的方法檢測(cè)阻斷T淋巴細(xì)胞入腦前后神經(jīng)元表達(dá)活化caspase-3片段的變化。 4、應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)AD模型大鼠腦微血管內(nèi)皮表達(dá)MHC-Ⅰ的改變。 二、體外實(shí)驗(yàn) 1、使用Aβ_(1-42)作用于人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMECs)后應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blot)方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)MHC-Ⅰ蛋白表達(dá)的變化。 2、使用BV_2培養(yǎng)上清液作用于HBMECs后應(yīng)用Western-blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)MHC-Ⅰ蛋白表達(dá)的變化。 3、使用Aβ_(1-42)刺激的BV_2培養(yǎng)上清液作用于HBMECs后應(yīng)用Western-blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)MHC-Ⅰ蛋白表達(dá)的變化。 4、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Aβ_(1-42)作用于HBMECs不同時(shí)間,內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅰ變化。 結(jié)果 1、成功制備了Aβ在海馬部位沉積的AD動(dòng)物模型。 2、大鼠雙側(cè)海馬注射聚集態(tài)Aβ_(1-42)模型組與注射Aβ_(1-42)對(duì)照組比較,小膠質(zhì)細(xì)胞活化增多。 Aβ沉積引起CD11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加并活化,與對(duì)照組比,差異性顯著(P＜0.01),表現(xiàn)為由靜止的分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨陌⒚装蜖?主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類分子陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量也比對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)。 3、進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的T淋巴細(xì)胞增強(qiáng)了Aβ沉積所引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。 大鼠雙側(cè)海馬注射聚集態(tài)Aβ_(1-42)后,腹腔注射SB-332235-Z與腹腔注射peg-400對(duì)照組相比,CD11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少,MHC-Ⅱ類分子陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量也比對(duì)照組顯著減少。 4、阻斷T淋巴細(xì)胞入腦可以減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。 大鼠雙側(cè)海馬注射聚集態(tài)Aβ_(1-42)后,腹腔注射SB-332235-Z與腹腔注射peg-400對(duì)照組相比,抑制了海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 5、AD模型大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅰ分子升高,可能參與T淋巴細(xì)胞入腦抗原提呈過程。 結(jié)論 阻斷T淋巴細(xì)胞入腦減弱了Aβ沉積所引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,也抑制了神經(jīng)元的凋亡;腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅰ是否參與T淋巴細(xì)胞入腦過程有待于進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392.32

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1 傅q，

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