【摘要】： 胚胎干細(xì)胞具有自我更新及多向分化潛能,為發(fā)育學(xué)、遺傳學(xué)、人類疾病的發(fā)病機(jī)理與替代治療等研究提供非常寶貴的資源。由于其應(yīng)用價(jià)值,科學(xué)家們?cè)鴩L試通過不同途徑實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程以獲取ES細(xì)胞或ES細(xì)胞樣的細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞(Induced pluripotentstem cells,iPS cells),這些途徑主要包括體細(xì)胞核移植、體細(xì)胞與多潛能細(xì)胞融合后的重編程、將分化的體細(xì)胞在卵細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞的抽提物中孵育以實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程、體細(xì)胞經(jīng)特定因子誘導(dǎo)重編程為iPS細(xì)胞。雖然運(yùn)用前三種方法可以獲得多潛能干細(xì)胞,但是這些方法的廣泛應(yīng)用在技術(shù)、細(xì)胞來源、免疫排斥、倫理、宗教和法律等方面存在諸多限制,而iPS細(xì)胞不受這些問題的限制,且制備簡(jiǎn)單易行;相對(duì)體細(xì)胞核移植技術(shù)而言,iPS細(xì)胞技術(shù)為體細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞重編程機(jī)制研究提供了理想而簡(jiǎn)便的體外研究體系,正因?yàn)閕PS細(xì)胞技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),以前采用體細(xì)胞核移植技術(shù)研究體細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞重編程機(jī)制的科學(xué)家紛紛放棄該技術(shù),轉(zhuǎn)而采用iPS細(xì)胞技術(shù)。 鑒于此,本試驗(yàn)擬借助慢病毒載體法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因?qū)胄∈笈咛コ衫w維細(xì)胞(MEFs),進(jìn)而將其重編程為iPS細(xì)胞,以實(shí)現(xiàn)下列目標(biāo):(1)熟練掌握基于慢病毒載體法將體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的技術(shù),以為下一步利用iPS細(xì)胞技術(shù)研究腫瘤細(xì)胞重編程機(jī)制提供技術(shù)保障;(2)建立小鼠iPS細(xì)胞系,以為后續(xù)研究[如iPS細(xì)胞生物學(xué)特性和行為(如自我復(fù)制、增殖和分化等)調(diào)控機(jī)制研究)奠定基礎(chǔ)。 目的: 借助慢病毒載體法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因?qū)胄∈笈咛コ衫w維細(xì)胞(MEFs),進(jìn)而將其重編程為iPS細(xì)胞,以實(shí)現(xiàn)多種目的(見上)。 方法: 1慢病毒載體pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W的鑒定 酶切鑒定分別使用EcoRⅠ、KpnⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ對(duì)pHAGE2-EF1α-STEMMCA進(jìn)行酶切,分別使用EcoRⅠ、PvuⅡ和BamHⅠ、XhoⅠ對(duì)pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W進(jìn)行酶切;酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.6%瓊脂糖凝膠電泳。 PCR鑒定根據(jù)Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2序列設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因;PCR擴(kuò)增后,取5μl反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。 2慢病毒生產(chǎn)與成功生產(chǎn)鑒定 慢病毒包裝與濃縮按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行慢病毒包裝(脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)、超速離心濃縮和保存等。 慢病毒成功生產(chǎn)的鑒定用病毒上清或濃縮后的病毒感染293FT細(xì)胞,24～48h后熒光顯微鏡下觀察是否見綠色熒光。 3利用細(xì)胞模型在體外驗(yàn)證EGFP能否正常表達(dá) 用病毒上清感染MEFs,24～48h后熒光顯微鏡下觀察是否見綠色熒光。 4慢病毒載體法重編程MEFs為iPS細(xì)胞 用濃縮病毒感染攜帶有Pou5f1-EGFP基因的MEFs,12h后棄病毒感染液,更換為鼠ES細(xì)胞培基,之后每天更換培基直到第二十天克隆足夠大時(shí)挑克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。 5鼠iPS細(xì)胞建系及其生物學(xué)特性鑒定 1) iPS細(xì)胞克隆上綠色熒光蛋白基因表達(dá)情況 2)所有iPS細(xì)胞系傳代培養(yǎng)至第5代后,進(jìn)行AKP染色鑒定; 3)提取iPS細(xì)胞總RNA,并進(jìn)而通過RT-PCR檢測(cè)鼠ES細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá); 4)懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體形成及分化情況; 5) iPS細(xì)胞接種至SCID小鼠皮下,觀察畸胎瘤形成情況。 結(jié)果: 1慢病毒載體pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W鑒定 酶切鑒定pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W經(jīng)EcoRⅠ單酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)0.6%瓊脂糖凝膠電泳均可見一條預(yù)期大小的條帶;pHAGE2-EF1α-STEMMCA經(jīng)KpnⅠ單酶切和EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切酶切產(chǎn)物經(jīng)0.6%瓊脂糖凝膠電泳均可見兩條預(yù)期大小的條帶;pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W經(jīng)PvuⅡ單酶切和BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)0.6%瓊脂糖凝膠電泳均可見兩條預(yù)期大小的條帶。 PCR鑒定以質(zhì)粒pHAGE2-EF1α-STEMMCA為模板,分別擴(kuò)增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因,PCR產(chǎn)物大小均與預(yù)期值相符。 2慢病毒包裝、濃縮及鑒定 攜帶EGFP基因慢病毒的生產(chǎn)與鑒定將pHAGE2-EFlaFull-ZsGreen-W與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,48h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光,預(yù)示轉(zhuǎn)染成功。用收集的病毒上清感染293FT細(xì)胞,48h后倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,這進(jìn)一步說明病毒已成功生產(chǎn);同時(shí)也表明EGFP轉(zhuǎn)基因能夠正常表達(dá)。 攜帶Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因的慢病毒生產(chǎn)與鑒定將pHAGE2-EF1α-STEMMCA與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,48h后倒置熒光顯微鏡下可見合包體和細(xì)胞融合現(xiàn)象,預(yù)示病毒正在生產(chǎn)。 3利用細(xì)胞模型在體外驗(yàn)證EGFP能否正常表達(dá) 用攜帶EGFP基因的慢病毒感染MEFs,48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,這表明轉(zhuǎn)基因EGFP在MEFs內(nèi)能夠正常表達(dá)。 4慢病毒載體法重編程MEFs為iPS細(xì)胞 病毒感染后第4天可見到ES克隆出現(xiàn),第20天克隆足夠大可以挑克隆以擴(kuò)大培養(yǎng),預(yù)示著MEFs已開始重編程。 5.iPS細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定 1)第9天可見到有綠色熒光的iPS細(xì)胞克隆出現(xiàn); 2) 4株iPS細(xì)胞系均具有典型的ES細(xì)胞克隆形態(tài),AKP染色呈強(qiáng)陽性; 3) 4株iPS細(xì)胞系均表達(dá)ES細(xì)胞特有的標(biāo)志性基因; 4) 4株iPS細(xì)胞系均具有體外分化形成囊性擬胚體的能力,且可以分化為心肌細(xì)胞; 5) 4株iPS細(xì)胞系均能形成畸胎瘤。 結(jié)論: 1.運(yùn)用Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2四種基因成功將MEFs重編程為iPS細(xì)胞。 2.4株iPS細(xì)胞系均具有鼠ES細(xì)胞的一些生物學(xué)特,且在體外長期傳代中能夠維持此特性,初步證明建立了小鼠iPS細(xì)胞系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2450757