【摘要】： 高能量的創(chuàng)傷,骨髓炎,骨腫瘤等造成的大段骨缺損是困擾骨科醫(yī)生的難題。骨組織工程研究為骨缺損的治療提供了一種良好的途徑。但工程化人工骨植入體內(nèi)后能否成活依賴于能否實現(xiàn)有效血管化以從宿主獲得足夠的營養(yǎng)。血管化問題成為制約工程化人工骨應(yīng)用于臨床的瓶頸。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種特異的與血管生長有關(guān)的因子,能增加血管的通透性,刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)新生血管的形成。但是,VEGF誘導(dǎo)的新生血管滲漏性強(qiáng),不成熟,難以發(fā)揮正常功能。血管生成素(Angiopoietin-1,ANG-1)在血管的塑形中起重要作用,可以募集血管周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,使新生血管結(jié)構(gòu)保持完整。本課題組擬構(gòu)建編碼人VEGF165和ANG-1雙基因的腺病毒載體pAd-VIA,以期轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)促進(jìn)組織工程骨植入體內(nèi)后的快速血管化。然而,轉(zhuǎn)染雙基因后,BMSCs的生物學(xué)活性是否會受影響,尚不清楚。本實驗旨在研究腺病毒載體pAd-VIA轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后,外源基因體外表達(dá)情況,及轉(zhuǎn)染對大鼠BMSCs增殖及成骨分化能力的影響,為下一步構(gòu)建具有血管化功能的組織工程人工骨修復(fù)大段骨缺損奠定理論基礎(chǔ)。 1重組合腺病毒載體pAd-VIA的制備及滴度測定 目的制備攜帶人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體pAd-VIA,為下一步實驗提供基因轉(zhuǎn)染工具。方法將本室構(gòu)建的編碼人VEGF165和ANG-1雙基因的腺病毒質(zhì)粒P-VIA用PacI酶切使之線形化,進(jìn)而使用AdEasyTM腺病毒系統(tǒng)重組并包裝腺病毒,通過綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá),光鏡下細(xì)胞形態(tài)的改變來評價,并進(jìn)行大量擴(kuò)增,利用50%組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)檢測病毒滴度。結(jié)果腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞8d后光鏡下可見細(xì)胞圓縮、聚集呈菌落狀的典型細(xì)胞病理性改變(CPE);熒光顯微鏡下可見GFP表達(dá),且熒光強(qiáng)度隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增強(qiáng);經(jīng)多輪感染、擴(kuò)增后獲得高滴度的腺病毒載體。病毒滴度為2×1010PFU/ml。結(jié)論成功構(gòu)建攜帶人VEGF165和ANG-1雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體pAd-VIA,為組織工程人工骨血管化的研究奠定基礎(chǔ)。 2雙基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs體外表達(dá)的鑒定及對其增殖的影響 目的探討攜帶人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)雙基因的腺病毒表達(dá)載體pAd-VIA轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的體外表達(dá)及對BMSCs增殖的影響。方法將本室構(gòu)建的編碼人VEGF165和ANG-1雙基因的重組合腺病毒載體pAd-VIA體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,通過綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)、Western-blotting、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法檢測外源基因的表達(dá),利用MTT法檢測感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection ,MOI)分別為50、100、200、400不同濃度腺病毒轉(zhuǎn)染后對BMSCs的增殖活性的影響。結(jié)果重組腺病毒載體pAd-VIA體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后,有大量的GFP表達(dá),Western-blotting檢測顯示,轉(zhuǎn)染組與VEGF165和ANG-1抗體結(jié)合,在45KD和14.4KD左右出現(xiàn)印跡條帶;ELISA結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組第1、2、3d,上清中的VEGF165濃度和ANG-1濃度持續(xù)增加,未轉(zhuǎn)染組幾乎未檢測到外源基因的表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);不同濃度的腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs后,促進(jìn)細(xì)胞增殖,細(xì)胞生長曲線上移,在1、3、5、7d轉(zhuǎn)染組的OD值均大于未轉(zhuǎn)染組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),第9d,細(xì)胞進(jìn)入平臺期,轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論重組腺病毒pAd-VIA轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后,外源基因在體外得到有效表達(dá),同時在觀察時間內(nèi)可以促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖。 3雙基因轉(zhuǎn)染對大鼠BMSCs成骨分化潛能的影響 目的研究聯(lián)合轉(zhuǎn)染人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165(VEGF165)和血管緊張素-1(ANG-1)雙基因?qū)Υ笫蠊撬杌|(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨分化潛能的影響。方法將本室構(gòu)建的編碼人VEGF165和ANG-1雙基因腺病毒載體pAd-VIA體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,應(yīng)用含維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉的誘導(dǎo)培養(yǎng)液定向誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化。實驗分為四組:A:腺病毒載體pAd-VIA轉(zhuǎn)染BMSCs并誘導(dǎo)組;B:BMSCs誘導(dǎo)組; C:腺病毒載體pAd-VIA轉(zhuǎn)染BMSCs組;D:單純BMSCs組。通過堿性磷酸酶(ALP)染色和活性的測定、I型膠原和骨鈣素免疫熒光染色、茜素紅染色來評價聯(lián)合轉(zhuǎn)染雙基因?qū)Υ笫驜MSCs成骨分化潛能的影響。結(jié)果重組腺病毒載體pAd-VIA體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后,A組和B組的ALP染色、I型膠原和骨鈣素免疫熒光染色、茜素紅染色為陽性,而C組和D組為陰性。ALP活性表達(dá)具有時間相關(guān)性,3d開始表達(dá),7d到達(dá)高峰,在7和14d,A、B組與C組和D組之間ALP表達(dá)均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),A組和B組之間,在各個時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論腺病毒載體pAd-VIA轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后,未明顯影響其體外成骨分化潛能。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 盧華定,蔡道章;自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療兔膝關(guān)節(jié)半月板無血運(yùn)區(qū)損傷[J];中華實驗外科雜志;2000年04期

2 胡學(xué)峰,王臻,張榮慶,王海燕;血管內(nèi)皮生長因子在人工骨血管化中的應(yīng)用[J];中國矯形外科雜志;2005年12期

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本文編號：2449928