【摘要】： 目的:惡性腫瘤其難以治愈的原因之一與腫瘤的免疫逃逸有關。人體的抗腫瘤免疫是以T細胞介導的細胞免疫為主,T細胞的活化需雙信號刺激:第一信號由T細胞抗原受體(TCR)與抗原提呈細胞(APC)上的抗原肽MHC分子復合物結合提供,第二信號由APC上的共刺激分子與T細胞上的相應配體提供,只有雙信號共同刺激才能有效激活特異性的T細胞,完成細胞免疫,消滅腫瘤細胞。大量研究證實腫瘤細胞可通過缺乏共刺激分子的方式逃避機體免疫。 目前認為樹突狀細胞(dendritic cell DC)是效率最高,最具潛能的抗原提呈細胞(APC),在誘導、調節(jié)、維持機體抗腫瘤免疫中起核心作用,其獨特功能表現在識別和吞噬病原體,將大分子抗原加工成肽段,刺激未致敏T細胞產生特異性免疫應答。用帶著腫瘤抗原的DC誘導機體抗腫瘤免疫是頗具潛力的免疫治療方法。近年來,以樹突狀細胞為基礎的腫瘤免疫報道很多,研究報道,DC疫苗在部分惡性腫瘤的治療中顯示出良好的效果。 4-1BB和4-1BBL是CD28/B7之外的另一對重要的協(xié)同刺激信號,在免疫應答、腫瘤免疫和自身免疫性疾病中起重要作用。4-1BB/4-1BBL在細胞間相互作用、細胞粘附、抗原遞呈、T細胞共刺激以及信號傳導中起不同的作用。4-1BB和其配體4-1BBL介導的共刺激信號是激發(fā)有效的抗腫瘤細胞免疫應答尤其是長期抗腫瘤效應所必需的,有望為腫瘤生物治療開拓新的途徑。 本實驗研究把共刺激分子4-1BBL基因導入胃癌細胞,再提取此胃癌細胞的總RNA轉染DC,制備腫瘤疫苗,觀察其體內的抗腫瘤效應。為以DC為基礎的胃癌免疫治療提供新的策略,同時為進一步應用于臨床奠定理論基礎。 方法: 1用脂質體法把pMKITneo/4-1BBL基因導入615小鼠胃癌細胞MFC內,G418篩選陽性克隆而成為MFC/4-1BBL細胞。 2逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)鑒定轉染細胞中4-1BBL基因mRNA的存在。 3自615小鼠骨髓組織中分離樹突狀細胞(DC),并進行體外培養(yǎng)使之進一步增量和成熟。 4用脂質體包裹MFC/4-1BBL細胞總RNA轉染小鼠樹突狀細胞,制備DC/4-1BBL/RNA疫苗。 5取615小鼠,均接種MFC細胞,建立荷瘤小鼠胃癌模型。隨機分為對照組、DC組、DC/MFC組和DC/MFC/4-1BBL組。用疫苗皮下注射治療。觀察其腫瘤生長情況和免疫狀態(tài)。所有實驗數據用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理,P0.05時認為差異具有顯著性。 結果: 1 pMKITneo/4-1BBL質粒酶切鑒定 抽提所得質粒用XhoI、NotI酶切,證實pMKITneo/4-1BBL質粒有927bp片斷脫落;pMKITneo表達載體質粒變?yōu)榧s5.8kb線性化載體,與理論值相符,證明pMKITneo/4-1BBL質粒正確存在并被成功擴增,同時也證實其為重組克隆。 2 4-1BBL基因轉染MFC細胞后的鑒定 小鼠胃癌細胞株MFC經脂質體法轉染4-1BBL基因、G418篩選后,均獲得了陽性克隆,稱為MFC/4-1BBL。用MFC/4-1BBL細胞提取總RNA,反轉錄合成cDNA,再以小鼠4-1BBL的特異性引物進行PCR擴增,可得到616bp的特異性條帶,證實有4-1BBL的mRNA較強表達,而未轉染4-1BBL基因的MFC細胞則有較弱的4-1BBLmRNA的表達。 3骨髓來源的DC的制備及細胞表型鑒定 小鼠骨髓單核細胞在含10%FBS、rmGM-CFS和rmIL-4的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至第七天即分化成形態(tài)正常的DC。采用流式細胞儀進行DC表型分析,CD11c陽性表達可達80%以上。 4腫瘤疫苗對荷瘤小鼠的生長情況及免疫狀況的影響 4.1荷瘤小鼠一般狀況 正常615小鼠活動力強,反應迅速,正常覓食;腫瘤細胞接種兩周后,各組小鼠活動力均下降,反應遲鈍,食欲減退,尤以對照組和DC組小鼠顯著。末次免疫后一周處死小鼠,各組小鼠的腫瘤組織位于皮下生長,與周圍組織稍有粘連,包膜完整,較易剝離,質軟,瘤體表面密布增生血管。 4.2各組小鼠腫瘤瘤重和抑瘤率的比較 比較各組瘤體重量由高到低為對照組(3.82g±0.57)、DC組(3.63g±0.51)、DC/MFC組(2.67g±0.32)、DC/MFC/4-1BBL組(2.06g±0.39)。DC/MFC/4-1BBL組的平均瘤重最低,與其它各組比較均有統(tǒng)計學差異(P 0.05),且抑瘤率最高,抑瘤效果最好; DC/MFC組平均瘤重顯著小于對照組(P 0.05),其抑瘤率明顯高于DC組; DC組的平均瘤重小于對照組,但二者之間差異無統(tǒng)計學意義(P 0.05)。 4.3各組小鼠腫瘤組織凋亡率的比較 對荷瘤615小鼠的胃癌組織用流式細胞術測定其細胞凋亡情況,發(fā)現其凋亡率由高到低為DC/MFC/4-1BBL組(28.58%±2.84)、DC/MFC組(25.03%±1.88)、DC組(20.66%±2.71)、對照組( 19.09%±2.73 ),DC/MFC/4-1BBL組與其它治療組和對照組比較有統(tǒng)計學差異,P 0.05。DC/MFC組與DC組和對照組比較有統(tǒng)計學差異(P 0.05),DC組與對照組之間差異無統(tǒng)計學差異(P 0.05)。 4.4各組小鼠全身免疫狀態(tài)的觀察 CD4~+T細胞含量:DC/MFC/4-1BBL組與其它治療組和對照組比較有統(tǒng)計學差異,P 0.05。DC/MFC組與DC組和對照組比較有統(tǒng)計學差異(P 0.05),DC組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P 0.05);CD8+T細胞的含量:各治療組與對照組無統(tǒng)計學差異,P 0.05。NK細胞的含量:DC/MFC/4-1BBL組與其它治療組和對照組比較有統(tǒng)計學差異,P 0.05。DC/MFC組與DC組和對照組比較有統(tǒng)計學差異(P 0.05),DC組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論: 1 4-1BBL基因應用脂質體法轉染后,可以在小鼠胃癌MFC細胞內穩(wěn)定表達。 2與其它各組相比,DC/MFC/4-1BBL瘤苗能明顯延緩荷瘤小鼠胃癌細胞的生長,瘤體重量輕,抑瘤率高于其它治療組。表現出更強的體內抑制腫瘤生長的活性 3 DC/MFC/4-1BBL治療組的腫瘤細胞凋亡率高于其它各組,提示DC/MFC/4-1BBL瘤苗能夠促進腫瘤細胞的凋亡。 4與其它各組相比,DC/MFC/4-1BBL疫苗治療615荷瘤小鼠后外周血中CD4~+T細胞和NK細胞均處于一個較高的水平,提示此疫苗能夠提高荷瘤宿主的免疫力。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392;R735.2

【參考文獻】

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1 羅榮城;尤長宣;;基因修飾樹突狀細胞介導腫瘤治療的進展與展望[J];臨床腫瘤學雜志;2006年06期

2 羅建飛,陳必成,陳忠華;小鼠骨髓來源樹突狀細胞的分離與擴增培養(yǎng)[J];微循環(huán)學雜志;2005年01期

3 謝紹建;閆慶輝;單保恩;付澤嫻;孟繁杰;李保東;蔡建輝;;轉染自體胃癌細胞總RNA的樹突狀細胞誘導個體化免疫治療的體外實驗[J];細胞與分子免疫學雜志;2006年01期

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本文編號：2445164