【摘要】： 目的:惡性腫瘤其難以治愈的原因之一與腫瘤的免疫逃逸有關(guān)。人體的抗腫瘤免疫是以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主,T細(xì)胞的活化需雙信號(hào)刺激:第一信號(hào)由T細(xì)胞抗原受體(TCR)與抗原提呈細(xì)胞(APC)上的抗原肽MHC分子復(fù)合物結(jié)合提供,第二信號(hào)由APC上的共刺激分子與T細(xì)胞上的相應(yīng)配體提供,只有雙信號(hào)共同刺激才能有效激活特異性的T細(xì)胞,完成細(xì)胞免疫,消滅腫瘤細(xì)胞。大量研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞可通過缺乏共刺激分子的方式逃避機(jī)體免疫。 目前認(rèn)為樹突狀細(xì)胞(dendritic cell DC)是效率最高,最具潛能的抗原提呈細(xì)胞(APC),在誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)、維持機(jī)體抗腫瘤免疫中起核心作用,其獨(dú)特功能表現(xiàn)在識(shí)別和吞噬病原體,將大分子抗原加工成肽段,刺激未致敏T細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。用帶著腫瘤抗原的DC誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫是頗具潛力的免疫治療方法。近年來,以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫報(bào)道很多,研究報(bào)道,DC疫苗在部分惡性腫瘤的治療中顯示出良好的效果。 4-1BB和4-1BBL是CD28/B7之外的另一對重要的協(xié)同刺激信號(hào),在免疫應(yīng)答、腫瘤免疫和自身免疫性疾病中起重要作用。4-1BB/4-1BBL在細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞粘附、抗原遞呈、T細(xì)胞共刺激以及信號(hào)傳導(dǎo)中起不同的作用。4-1BB和其配體4-1BBL介導(dǎo)的共刺激信號(hào)是激發(fā)有效的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答尤其是長期抗腫瘤效應(yīng)所必需的,有望為腫瘤生物治療開拓新的途徑。 本實(shí)驗(yàn)研究把共刺激分子4-1BBL基因?qū)胛赴┘?xì)胞,再提取此胃癌細(xì)胞的總RNA轉(zhuǎn)染DC,制備腫瘤疫苗,觀察其體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)。為以DC為基礎(chǔ)的胃癌免疫治療提供新的策略,同時(shí)為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。 方法: 1用脂質(zhì)體法把pMKITneo/4-1BBL基因?qū)?15小鼠胃癌細(xì)胞MFC內(nèi),G418篩選陽性克隆而成為MFC/4-1BBL細(xì)胞。 2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中4-1BBL基因mRNA的存在。 3自615小鼠骨髓組織中分離樹突狀細(xì)胞(DC),并進(jìn)行體外培養(yǎng)使之進(jìn)一步增量和成熟。 4用脂質(zhì)體包裹MFC/4-1BBL細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細(xì)胞,制備DC/4-1BBL/RNA疫苗。 5取615小鼠,均接種MFC細(xì)胞,建立荷瘤小鼠胃癌模型。隨機(jī)分為對照組、DC組、DC/MFC組和DC/MFC/4-1BBL組。用疫苗皮下注射治療。觀察其腫瘤生長情況和免疫狀態(tài)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,P0.05時(shí)認(rèn)為差異具有顯著性。 結(jié)果: 1 pMKITneo/4-1BBL質(zhì)粒酶切鑒定 抽提所得質(zhì)粒用XhoI、NotI酶切,證實(shí)pMKITneo/4-1BBL質(zhì)粒有927bp片斷脫落;pMKITneo表達(dá)載體質(zhì)粒變?yōu)榧s5.8kb線性化載體,與理論值相符,證明pMKITneo/4-1BBL質(zhì)粒正確存在并被成功擴(kuò)增,同時(shí)也證實(shí)其為重組克隆。 2 4-1BBL基因轉(zhuǎn)染MFC細(xì)胞后的鑒定 小鼠胃癌細(xì)胞株MFC經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染4-1BBL基因、G418篩選后,均獲得了陽性克隆,稱為MFC/4-1BBL。用MFC/4-1BBL細(xì)胞提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以小鼠4-1BBL的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可得到616bp的特異性條帶,證實(shí)有4-1BBL的mRNA較強(qiáng)表達(dá),而未轉(zhuǎn)染4-1BBL基因的MFC細(xì)胞則有較弱的4-1BBLmRNA的表達(dá)。 3骨髓來源的DC的制備及細(xì)胞表型鑒定 小鼠骨髓單核細(xì)胞在含10%FBS、rmGM-CFS和rmIL-4的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至第七天即分化成形態(tài)正常的DC。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DC表型分析,CD11c陽性表達(dá)可達(dá)80%以上。 4腫瘤疫苗對荷瘤小鼠的生長情況及免疫狀況的影響 4.1荷瘤小鼠一般狀況 正常615小鼠活動(dòng)力強(qiáng),反應(yīng)迅速,正常覓食;腫瘤細(xì)胞接種兩周后,各組小鼠活動(dòng)力均下降,反應(yīng)遲鈍,食欲減退,尤以對照組和DC組小鼠顯著。末次免疫后一周處死小鼠,各組小鼠的腫瘤組織位于皮下生長,與周圍組織稍有粘連,包膜完整,較易剝離,質(zhì)軟,瘤體表面密布增生血管。 4.2各組小鼠腫瘤瘤重和抑瘤率的比較 比較各組瘤體重量由高到低為對照組(3.82g±0.57)、DC組(3.63g±0.51)、DC/MFC組(2.67g±0.32)、DC/MFC/4-1BBL組(2.06g±0.39)。DC/MFC/4-1BBL組的平均瘤重最低,與其它各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05),且抑瘤率最高,抑瘤效果最好; DC/MFC組平均瘤重顯著小于對照組(P 0.05),其抑瘤率明顯高于DC組; DC組的平均瘤重小于對照組,但二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。 4.3各組小鼠腫瘤組織凋亡率的比較 對荷瘤615小鼠的胃癌組織用流式細(xì)胞術(shù)測定其細(xì)胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)其凋亡率由高到低為DC/MFC/4-1BBL組(28.58%±2.84)、DC/MFC組(25.03%±1.88)、DC組(20.66%±2.71)、對照組( 19.09%±2.73 ),DC/MFC/4-1BBL組與其它治療組和對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P 0.05。DC/MFC組與DC組和對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05),DC組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05)。 4.4各組小鼠全身免疫狀態(tài)的觀察 CD4~+T細(xì)胞含量:DC/MFC/4-1BBL組與其它治療組和對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P 0.05。DC/MFC組與DC組和對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05),DC組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05);CD8+T細(xì)胞的含量:各治療組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P 0.05。NK細(xì)胞的含量:DC/MFC/4-1BBL組與其它治療組和對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P 0.05。DC/MFC組與DC組和對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05),DC組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論: 1 4-1BBL基因應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染后,可以在小鼠胃癌MFC細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。 2與其它各組相比,DC/MFC/4-1BBL瘤苗能明顯延緩荷瘤小鼠胃癌細(xì)胞的生長,瘤體重量輕,抑瘤率高于其它治療組。表現(xiàn)出更強(qiáng)的體內(nèi)抑制腫瘤生長的活性 3 DC/MFC/4-1BBL治療組的腫瘤細(xì)胞凋亡率高于其它各組,提示DC/MFC/4-1BBL瘤苗能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。 4與其它各組相比,DC/MFC/4-1BBL疫苗治療615荷瘤小鼠后外周血中CD4~+T細(xì)胞和NK細(xì)胞均處于一個(gè)較高的水平,提示此疫苗能夠提高荷瘤宿主的免疫力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392;R735.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 羅榮城;尤長宣;;基因修飾樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤治療的進(jìn)展與展望[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2006年06期

2 羅建飛,陳必成,陳忠華;小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的分離與擴(kuò)增培養(yǎng)[J];微循環(huán)學(xué)雜志;2005年01期

3 謝紹建;閆慶輝;單保恩;付澤嫻;孟繁杰;李保東;蔡建輝;;轉(zhuǎn)染自體胃癌細(xì)胞總RNA的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)個(gè)體化免疫治療的體外實(shí)驗(yàn)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年01期

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本文編號(hào)：2445164