【摘要】： 一直以來,奶牛乳腺炎嚴重影響到奶牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,而金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要病原菌之一,從患乳腺炎的奶牛分泌的乳汁中分離出的金葡菌94%-100%的細菌細胞壁帶有莢膜,70%-80%的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生5型或8型莢膜多糖,因此造成奶牛金黃色葡萄球菌乳腺炎的主要因素被認為是CP5和CP8。金黃色葡萄球菌表面的莢膜多糖與細菌的毒力和抗吞噬作用有關(guān),致使金葡菌不能被免疫系統(tǒng)有效清除。 研制能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和免疫記憶反應(yīng)的特異性莢膜多糖疫苗可能是預防奶牛乳腺炎的有效途徑之一,然而莢膜多糖屬于小分子,是不完全抗原,不能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和免疫記憶反應(yīng),因此不能作為獨立的抗原使用。通過化學方法利用載體蛋白與莢膜多糖偶聯(lián),制備能夠刺激機體產(chǎn)生特異性莢膜多糖抗體的大分子偶聯(lián)物,提高小分子莢膜多糖的免疫原性的技術(shù)在國內(nèi)外已有報道。 在試驗過程中,我們以己二酰肼為間橋,碳二亞胺為偶聯(lián)劑,將莢膜多糖與不同的載體蛋白偶聯(lián)制備大分子結(jié)合物。由于細菌的鞭毛蛋白具有佐劑作用,可以增強免疫應(yīng)答,因此在載體的選擇方面,我們以鞭毛蛋白為主要的研究對象,研究其對莢膜多糖免疫原性的影響。為了提高鞭毛蛋白中賴氨酸的含量,我們在鞭毛蛋白的N末端加上一個多聚賴氨酸,以提高多糖衍生物對鞭毛蛋白的攻擊力,形成連續(xù)的多糖片段。由于連續(xù)的多糖片段和鞭毛蛋白的佐劑作用,我們可以得到更為有效的偶聯(lián)物。 在偶聯(lián)物的鑒定過程中,主要用薄層層析、Sepharose CL-6B層析圖譜、苯酚硫酸法測定多糖含量和酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法對偶聯(lián)物進行鑒定,結(jié)果證明偶聯(lián)物偶聯(lián)成功,并確定了偶聯(lián)率。 用金黃色葡萄球菌莢膜多糖偶聯(lián)物免疫小鼠,免疫采血后,采用間接ELISA法、MTT法和小鼠攻毒試驗檢測莢膜多糖偶聯(lián)物的免疫原性和攻毒保護作用。通過間接ELISA法檢測小鼠的抗體水平,結(jié)果顯示,二免后兩周,多糖偶聯(lián)物均表現(xiàn)出免疫原性,誘導小鼠產(chǎn)生特異性IgG、IgM莢膜多糖抗體,三免后的IgG抗體水平顯著高于二免小鼠的抗體水平,說明說明偶聯(lián)物小鼠產(chǎn)生了免疫記憶反應(yīng)。而單獨的多糖組,在第三次免疫后,沒有發(fā)生明顯的抗體水平的提高,同時也沒有產(chǎn)生免疫記憶反應(yīng)。在用多糖偶聯(lián)物免疫的小鼠中,用Lys-flic-cp免疫小鼠的抗體水平顯著的高于用flic-cp、flic-m-cp和BSA-cp免疫小鼠的抗體水平,flic-cp組小鼠的抗體水平顯著高于flic-m-cp和BSA-cp組小鼠的抗體水平,這說明lys-flic和flic具有免疫佐劑作用,能夠增強莢膜多糖偶聯(lián)物的體液免疫效果,同時lys-flic的佐劑作用較flic顯著增強。 在對小鼠的細胞免疫的研究過程中發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌莢膜多糖5型和8型均對小鼠脾臟淋巴細胞的增殖表現(xiàn)出一定的促進作用,然而,莢膜多糖與蛋白載體偶聯(lián)后,偶聯(lián)物極顯著的促進了小鼠T淋巴細胞的增殖。其中l(wèi)ys-flic-cp較flic-cp、bsa-cp和flic-m-cp具有更為顯著的促進T淋巴細胞增殖的作用,flic-cp較bsa-cp和flic-m-cpT淋巴細胞增殖作用也顯著提高,這表明lys-flic具有比flic更強的免疫增強作用。 本試驗中,我們對三免后的小鼠,在三免后的第14天進行攻毒保護試驗,攻毒結(jié)果表明,莢膜多糖偶聯(lián)物免疫小鼠的成活率高于單獨的多糖對照組,其中cp與lys-flic偶聯(lián)物免疫小鼠的成活率最高,提示lys-flic的免疫增強作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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