【摘要】： 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)屬皰疹病毒科,β皰疹病毒亞科,是感染人類最常見的病原體之一。該病毒在人體內(nèi)可持續(xù)終生潛伏感染,對(duì)免疫力正常人群無顯著影響,但是,如果由于疾病或其它原因?qū)е滤拗髅庖吡Φ拖?該病毒即可活化從而造成難以治愈的復(fù)雜疾病。HCMV的活化可引發(fā)器官移植和艾滋病患者等高危人群產(chǎn)生間質(zhì)性肺炎、肝炎、腦炎等嚴(yán)重復(fù)雜疾病,還可通過胎盤垂直傳播導(dǎo)致死胎、新生兒感覺神經(jīng)性聽力喪失或精神發(fā)育遲緩等不良后果;另外HCMV還可促進(jìn)器官移植后的免疫排斥反應(yīng)、惡性腫瘤以及動(dòng)脈粥樣硬化等重要疾病的發(fā)病進(jìn)程。由于HCMV在自然界廣泛存在,傳播途徑多樣,加之其感染正常群體一般無明顯癥狀,預(yù)防該病毒感染較難實(shí)現(xiàn),而體內(nèi)已有潛伏感染的病毒DNA難以清除,因此防治HCMV相關(guān)疾病的重點(diǎn)主要放在探尋病毒活化的機(jī)制,以便找尋有效的抑制病毒活化的手段。 HCMV的主要立即早期基因(MIE)的編碼產(chǎn)物對(duì)調(diào)節(jié)活化后的基因表達(dá)起著不可或缺的作用,該基因的表達(dá)決定著病毒復(fù)制的效率。MIE基因表達(dá)的異常增高標(biāo)志著HCMV轉(zhuǎn)向活化狀態(tài),因此,上游調(diào)控MIE基因表達(dá)的眾多分子成為研究HCMV活化的熱點(diǎn)。US28是一種HCMV編碼的在病毒活化的立即早期就表達(dá)的受體蛋白。研究表明,US28的變化先于MIE基因的轉(zhuǎn)錄,并能夠引起經(jīng)典的G蛋白相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這是由于US28分子G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)使其具有影響下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)從而激活多種轉(zhuǎn)錄因子的功能。被激活的多種轉(zhuǎn)錄因子,特別是通用轉(zhuǎn)錄因子——環(huán)單磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)很有可能參與MIE基因的轉(zhuǎn)錄激活,從而參與病毒活化的過程。 為了確定US28分子對(duì)MIE基因表達(dá)的影響以及作為HCMV活化的重要分子開關(guān)的作用,本研究重點(diǎn)開展了以下幾方面工作: 1.利用高保真酶從HCMV(AD169株)原液中擴(kuò)增出US28全長(zhǎng)表達(dá)序列,并將該基因克隆至真核表達(dá)載體上,以供胞內(nèi)表達(dá)該蛋白時(shí)使用。將重組質(zhì)粒的雙向測(cè)序得出的序列與已報(bào)道的AD169序列進(jìn)行同源性比對(duì)的結(jié)果表明,所克隆的US28基因與報(bào)道的序列完全相符。 2.將上述重組質(zhì)粒梯度轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中,24h后收獲細(xì)胞中的總蛋白,采用Western blot技術(shù)檢測(cè)其中CREB的生物活性形式——磷酸化CREB(p-CREB)量的變化情況,發(fā)現(xiàn)p-CREB與US28轉(zhuǎn)染量呈明顯的劑量依賴關(guān)系,這與單純加入腺苷酸環(huán)化酶激活劑forskolin的結(jié)果呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。而CREB分子的特異性阻遏物A-CREB在胞內(nèi)的表達(dá)未能影響到p-CREB量的變化。 3.建立了雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng),以觀察上游多種影響因素對(duì)MIE基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。該系統(tǒng)由螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因和海腎螢光素酶報(bào)告基因組成,本研究將MIE基因的增強(qiáng)/啟動(dòng)子克隆至螢火蟲螢光素酶基因之前引導(dǎo)該報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄;并選用單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)的啟動(dòng)子區(qū)域引導(dǎo)的海腎螢光素酶基因作為內(nèi)對(duì)照基因,這是由于該啟動(dòng)子不受本實(shí)驗(yàn)條件變化的影響。首先確定了兩種報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染比例,以保證兩基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性在一定范圍內(nèi)。之后將上述兩種報(bào)告基因與US28真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HEK293中,觀察US28對(duì)MIE基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。同時(shí),為了觀察US28對(duì)CREB相關(guān)轉(zhuǎn)錄活性的影響,本研究利用CREB指示報(bào)告基因(人糖蛋白激素α亞基基因部分增強(qiáng)/啟動(dòng)子引導(dǎo)的螢火蟲螢光素酶基因)與上述海腎螢光素酶基因構(gòu)成雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng),并通過在該系統(tǒng)中共轉(zhuǎn)染US28真核表達(dá)載體來觀察US28對(duì)CREB相關(guān)轉(zhuǎn)錄活性的影響。利用通路阻斷技術(shù)進(jìn)一步研究了CREB分子在US28調(diào)節(jié)MIE等基因的信號(hào)通路中所起的作用。研究結(jié)果顯示,在多種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)中可觀察到US28和forskolin均能提高M(jìn)IE與CREB指示報(bào)告基因增強(qiáng)/啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。US28對(duì)MIE等基因轉(zhuǎn)錄活性的促進(jìn)作用可被A-CREB部分阻斷,并且這種促進(jìn)作用可由添加forskolin而再次提升。這說明CREB在US28提高M(jìn)IE基因轉(zhuǎn)錄活性中具有重要的調(diào)節(jié)作用。 4.建立了Real-time PCR法檢測(cè)HCMV拷貝數(shù)的絕對(duì)定量的方法和檢測(cè)MIE基因表達(dá)水平的相對(duì)定量的方法,利用上述兩種方法觀察了HCMV感染其宿主細(xì)胞——人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL)后不同時(shí)間點(diǎn)病毒拷貝數(shù)與MIE基因表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示,MIE基因的表達(dá)產(chǎn)物在病毒感染細(xì)胞后短時(shí)間內(nèi)即可產(chǎn)生,其表達(dá)水平隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而呈指數(shù)增長(zhǎng),病毒拷貝數(shù)也隨之急劇增加。 本研究結(jié)果顯示:p-CREB的表達(dá)量與US28的轉(zhuǎn)染量呈劑量依賴關(guān)系,說明US28分子通過其下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)CREB活性形式的表達(dá)量,提示US28很可能促進(jìn)CREB相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。通過對(duì)US28導(dǎo)致CREB指示報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)的結(jié)果分析,進(jìn)一步證實(shí)了US28可促進(jìn)CREB相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。更為重要的是,US28還可促進(jìn)MIE基因的轉(zhuǎn)錄活性,并且這種促進(jìn)作用可被A-CREB所部分阻斷,說明CREB是該過程中的重要作用因子,而且是與其它轉(zhuǎn)錄因子共同參與這一促進(jìn)作用。MIE表達(dá)水平的指數(shù)增加與病毒活化導(dǎo)致的拷貝數(shù)增加在表達(dá)時(shí)相上有著先后出現(xiàn)的密切關(guān)系。由于US28能通過CREB有效促進(jìn)MIE基因的轉(zhuǎn)錄活性,而MIE基因的表達(dá)又與病毒拷貝數(shù)的增加密切相關(guān),這一主線說明US28在HCMV活化通路中起著重要作用。 本研究結(jié)果證明了US28通過CREB因子對(duì)于MIE基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)的重要作用,這一結(jié)果為找到HCMV活化初始MIE表達(dá)急劇增加的誘因提供了有效的線索,這為今后深入開展HCMV潛伏與活化的研究工作奠定了一定的理論基礎(chǔ),也為尋找新的抗HCMV藥物靶點(diǎn)提供了新的思路。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Cytomegalovirus and chronic allograft rejection in liver transplantation[J];World Journal of Gastroenterology;2004年13期

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本文編號(hào)：2439142