發(fā)布時(shí)間：2019-02-21 16:05

【摘要】：目的克隆并表達(dá)剛地弓形蟲(chóng)抑制蛋白(Tg PRF)基因,并分析其免疫反應(yīng)性。方法提取弓形蟲(chóng)RH株速殖子總RNA,根據(jù)Tg PRF的基因編碼序列設(shè)計(jì)引物,RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切后連接入p ET30a(+)載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌(E.coli)DH5α,經(jīng)雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定陽(yáng)性菌落。p ET30a(+)-Tg PRF轉(zhuǎn)化至E.coli BL21,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。重組蛋白經(jīng)鎳親和層析法純化后,以兔抗弓形蟲(chóng)血清為一抗,蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析r Tg PRF蛋白的免疫反應(yīng)性。結(jié)果 Tg PRF基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為492 bp。經(jīng)雙酶切、PCR和測(cè)序結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒p ET30a(+)-Tg PRF構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果顯示,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約35 000的可溶性重組蛋白。Western blotting結(jié)果顯示,r Tg PRF蛋白能被兔抗弓形蟲(chóng)血清識(shí)別。結(jié)論本研究克隆的Tg PRF基因序列能在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),且具有免疫反應(yīng)性。
[Abstract]:Objective to clone and express the (Tg PRF) gene of Toxoplasma gondii inhibitor and analyze its immunoreactivity. Methods the total RNA, of Toxoplasma gondii RH strain was extracted and primers were designed according to the coding sequence of Tg PRF. The amplified product of RT-PCR was digested by double enzyme and inserted into p ET30a () vector. The recombinant plasmid was transformed into E.coli DH5 偽 and digested by double enzyme. PCR and sequencing identified the positive colony. P ET30a ()-Tg PRF was transformed into E.coli BL21, and induced by isopropyl- 尾-D-galactoside (IPTG). Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with Coomassie brilliant blue staining was used to detect the expressed products. The recombinant protein was purified by nickel affinity chromatography and the rabbit anti-Toxoplasma gondii serum was used as the first antibody. Western blot (Western blotting) was used to analyze the immunoreactivity of r Tg PRF protein. Results the RT-PCR amplification product of Tg PRF gene was about 492 bp.. The results of double enzyme digestion, PCR and sequencing showed that the recombinant plasmid p ET30a ()-Tg PRF was successfully constructed. The results of SDS-PAGE showed that the soluble recombinant protein. Western blotting with relative molecular weight (Mr) of about 35 000 was obtained by IPTG induction. R Tg PRF protein can be recognized by rabbit antitoxoplasma serum. Conclusion the cloned Tg PRF gene sequence can be expressed in prokaryotic expression system and has immunoreactivity.
【作者單位】： 徐州醫(yī)學(xué)院解剖教研室;徐州醫(yī)學(xué)院感染與免疫實(shí)驗(yàn)室;中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲(chóng)病和絲蟲(chóng)病合作中心;
【基金】：衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(No.WSBKTKT201402) 徐州醫(yī)學(xué)院科研課題(No.2014KJ07)~~
【分類(lèi)號(hào)】：R382.5

【參考文獻(xiàn)】

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4 劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn);楊燕萍;殷國(guó)榮;王海龍;李雅清;祝建疆;劉宜升;;剛地弓形蟲(chóng)蘋(píng)果酸脫氫酶基因的克隆表達(dá)及免疫原性分析[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;2013年01期

【共引文獻(xiàn)】

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9 吳鍇;王海龍;殷國(guó)榮;孟曉麗;劉紅麗;;重組弓形蟲(chóng)Peroxiredoxin蛋白聯(lián)合佐劑皮下免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答動(dòng)態(tài)變化[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2010年10期

10 劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn);王海龍;孟曉麗;劉紅麗;申金雁;殷國(guó)榮;原飛;;重組剛地弓形蟲(chóng)Peroxiredoxin蛋白的純化及抗血清制備[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2011年03期

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2427654