【摘要】： SARS病毒只能感染人類、靈長(zhǎng)類等少數(shù)動(dòng)物,由于缺乏方便實(shí)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,使得對(duì)它的研究受到很大制約�；谀壳皩�(duì)SARS病毒的研究,人們發(fā)現(xiàn)了SARS病毒的受體是人的2型血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(hACE2),有研究通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染,在各種細(xì)胞中表達(dá)SARS病毒的功能性受體hACE2后,SARS病毒在所有的細(xì)胞中都能得以復(fù)制,只不過(guò)由于hACE2表達(dá)水平的不同產(chǎn)生的病毒的滴度有所差異,研究發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞并不感染SARS病毒,但轉(zhuǎn)染表達(dá)hACE2后細(xì)胞卻能夠支持病毒的感染和復(fù)制,并檢測(cè)到病毒滴度,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的出現(xiàn),提供了一種改變動(dòng)物的遺傳信息,使其獲得新的表型的方法。利用轉(zhuǎn)基因方法將人的病毒受體在小鼠體內(nèi)表達(dá),使只能感染人的病毒能感染小鼠,已經(jīng)為人類研究病毒的致病性和防治方法提供了方便有用的動(dòng)物模型。本研究將上述細(xì)胞水平的研究進(jìn)展和對(duì)SARS病毒受體的研究應(yīng)用于制備表達(dá)SARS冠狀病毒功能性受體hACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠,嘗試建立表達(dá)有hACE2基因的SARS病毒易感的小鼠模型,為此開(kāi)展了下面的研究。 以質(zhì)粒PCMV-SPORT6為模板,使用長(zhǎng)距離PCR方法擴(kuò)增獲得hACE2全長(zhǎng)cDNA序列,將其克隆進(jìn)PCAGGS的真核表達(dá)載體,并且添加了PGK-neo篩選標(biāo)記,通過(guò)脂質(zhì)體的方法我們轉(zhuǎn)染了小鼠的NIH3T3細(xì)胞,通過(guò)PCR和Southern的檢測(cè),我們得到了穩(wěn)定整合有hACE2基因的陽(yáng)性細(xì)胞株,通過(guò)Western免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)分析以及免疫熒光的方法我們檢測(cè)到了hACE2在小鼠NIH3T3細(xì)胞中廣泛表達(dá),并且通過(guò)體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了小鼠NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)的SARS病毒的受體蛋白hACE2能很好的同SARS病毒的S蛋白結(jié)合。 我們利用克隆的hACE2全長(zhǎng)cDNA序列構(gòu)建了兩個(gè)轉(zhuǎn)基因載體PCAGGS-hACE2和pCDNA3.1+-hACE2用于轉(zhuǎn)基因小鼠的制備。通過(guò)顯微注射的方法獲得了12只基因組中整合有hACE2的PCAGGS-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠和10只pCDNA3.1+-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR和Southern檢測(cè)都證實(shí)12只PCAGGS-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠和10只pCDNA3.1+-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組中的確整合有轉(zhuǎn)入基因,轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率分別為12.5%和9.1%,各個(gè)founder經(jīng)過(guò)傳代建立各相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠系。我們對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠系中外源性hACE2表達(dá)進(jìn)行了鑒定,首先我們提取了轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織的總RNA,進(jìn)行了RT-PCR的檢測(cè),結(jié)果表明PCAGGS-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的肺組織中有hACE2的轉(zhuǎn)錄,而pCDNA3.1+-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的肺組織中未檢測(cè)到hACE2的轉(zhuǎn)錄,證明PCAGGS在肺組織的表達(dá)效果優(yōu)于pCDNA3.1+表達(dá)載體。我們又分別提取了PCAGGS-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型陰性對(duì)照小鼠的肺組織總蛋白,用hACE2的多克隆抗體做Western免疫印跡。我們?cè)谵D(zhuǎn)基因小鼠肺組織中檢測(cè)到有hACE2的表達(dá),然后通過(guò)組織免疫熒光的方法,對(duì)肺組織表達(dá)的hACE2蛋白進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)它在肺實(shí)質(zhì)和肺泡上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)。 我們對(duì)小鼠肺組織中表達(dá)的hACE2的功能進(jìn)行了鑒定,我們用FITC標(biāo)記的SARS病毒的S蛋白,通過(guò)體外蛋白結(jié)合的方法檢測(cè)了SARS病毒的S蛋白與小鼠肺組織中表達(dá)的hACE2蛋白的結(jié)合能力,組織免疫熒光的結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠肺組織表達(dá)的hACE2蛋白能很好的同SARS病毒的S蛋白結(jié)合,而野生型陰性小鼠則不能很好的結(jié)合,至此我們獲得了表達(dá)有SARS病毒功能性受體hACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠,該轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為SARS病毒易感的動(dòng)物模型用于SARS相關(guān)的研究中。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 程萱,陳紅星,楊曉,譚曉紅,黃培堂;提高制備轉(zhuǎn)基因小鼠效率的研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2001年03期

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本文編號(hào)：2426202