【摘要】： SARS病毒只能感染人類、靈長類等少數動物,由于缺乏方便實用的實驗動物模型,使得對它的研究受到很大制約�；谀壳皩ARS病毒的研究,人們發(fā)現(xiàn)了SARS病毒的受體是人的2型血管緊張素轉換酶(hACE2),有研究通過細胞轉染,在各種細胞中表達SARS病毒的功能性受體hACE2后,SARS病毒在所有的細胞中都能得以復制,只不過由于hACE2表達水平的不同產生的病毒的滴度有所差異,研究發(fā)現(xiàn)某些細胞并不感染SARS病毒,但轉染表達hACE2后細胞卻能夠支持病毒的感染和復制,并檢測到病毒滴度,轉基因動物技術的出現(xiàn),提供了一種改變動物的遺傳信息,使其獲得新的表型的方法。利用轉基因方法將人的病毒受體在小鼠體內表達,使只能感染人的病毒能感染小鼠,已經為人類研究病毒的致病性和防治方法提供了方便有用的動物模型。本研究將上述細胞水平的研究進展和對SARS病毒受體的研究應用于制備表達SARS冠狀病毒功能性受體hACE2的轉基因小鼠,嘗試建立表達有hACE2基因的SARS病毒易感的小鼠模型,為此開展了下面的研究。 以質粒PCMV-SPORT6為模板,使用長距離PCR方法擴增獲得hACE2全長cDNA序列,將其克隆進PCAGGS的真核表達載體,并且添加了PGK-neo篩選標記,通過脂質體的方法我們轉染了小鼠的NIH3T3細胞,通過PCR和Southern的檢測,我們得到了穩(wěn)定整合有hACE2基因的陽性細胞株,通過Western免疫印跡、流式細胞術分析以及免疫熒光的方法我們檢測到了hACE2在小鼠NIH3T3細胞中廣泛表達,并且通過體外蛋白結合實驗證明了小鼠NIH3T3細胞中表達的SARS病毒的受體蛋白hACE2能很好的同SARS病毒的S蛋白結合。 我們利用克隆的hACE2全長cDNA序列構建了兩個轉基因載體PCAGGS-hACE2和pCDNA3.1+-hACE2用于轉基因小鼠的制備。通過顯微注射的方法獲得了12只基因組中整合有hACE2的PCAGGS-hACE2轉基因小鼠和10只pCDNA3.1+-hACE2轉基因小鼠。PCR和Southern檢測都證實12只PCAGGS-hACE2轉基因小鼠和10只pCDNA3.1+-hACE2轉基因小鼠的基因組中的確整合有轉入基因,轉基因陽性率分別為12.5%和9.1%,各個founder經過傳代建立各相應的轉基因小鼠系。我們對轉基因小鼠系中外源性hACE2表達進行了鑒定,首先我們提取了轉基因小鼠肺組織的總RNA,進行了RT-PCR的檢測,結果表明PCAGGS-hACE2轉基因小鼠的肺組織中有hACE2的轉錄,而pCDNA3.1+-hACE2轉基因小鼠的肺組織中未檢測到hACE2的轉錄,證明PCAGGS在肺組織的表達效果優(yōu)于pCDNA3.1+表達載體。我們又分別提取了PCAGGS-hACE2轉基因小鼠和野生型陰性對照小鼠的肺組織總蛋白,用hACE2的多克隆抗體做Western免疫印跡。我們在轉基因小鼠肺組織中檢測到有hACE2的表達,然后通過組織免疫熒光的方法,對肺組織表達的hACE2蛋白進行定位,發(fā)現(xiàn)它在肺實質和肺泡上皮細胞中廣泛表達。 我們對小鼠肺組織中表達的hACE2的功能進行了鑒定,我們用FITC標記的SARS病毒的S蛋白,通過體外蛋白結合的方法檢測了SARS病毒的S蛋白與小鼠肺組織中表達的hACE2蛋白的結合能力,組織免疫熒光的結果顯示,轉基因陽性小鼠肺組織表達的hACE2蛋白能很好的同SARS病毒的S蛋白結合,而野生型陰性小鼠則不能很好的結合,至此我們獲得了表達有SARS病毒功能性受體hACE2的轉基因小鼠,該轉基因小鼠可以作為SARS病毒易感的動物模型用于SARS相關的研究中。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R-332

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 程萱,陳紅星,楊曉,譚曉紅,黃培堂;提高制備轉基因小鼠效率的研究[J];中國實驗動物學報;2001年03期

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本文編號：2426202