發(fā)布時間：2019-02-18 13:57

【摘要】： 人胚胎多能性干細(xì)胞來源于原始生殖嵴(primordial germ cells, PGCs)和囊胚內(nèi)細(xì)胞團(inner cell mass,ICM),具有體外無限增殖能力和發(fā)育全能性等特征。PGCs和胚胎生殖細(xì)胞(embryonic germ cells,EG細(xì)胞)作為干細(xì)胞之母在發(fā)育生物學(xué)及生殖系腫瘤研究等領(lǐng)域有其獨特的理論和應(yīng)用價值。但自1998年美國科學(xué)家先后分離得到人EG細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES細(xì)胞)以來,人ES細(xì)胞的研究熱潮遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人EG細(xì)胞,究其原因為人EG細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻,難以獲得能長期在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系。因此優(yōu)化人EG細(xì)胞培養(yǎng)體系必將推動其深入研究。 飼養(yǎng)層(feeder cells)是體外成功培養(yǎng)人EG細(xì)胞的必要條件,因此尋找適合人EG細(xì)胞體外培養(yǎng)的飼養(yǎng)層是人EG細(xì)胞成功建系并用于實際的關(guān)鍵。目前在胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及建系過程中通常采用STO細(xì)胞系或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)作為飼養(yǎng)層,但小鼠來源的飼養(yǎng)層細(xì)胞可能給培養(yǎng)體系帶來異源蛋白和遺傳物質(zhì)及逆轉(zhuǎn)錄病毒等,給培養(yǎng)體系造成污染,成為限制胚胎干細(xì)胞臨床應(yīng)用的瓶頸。因此,有必要建立人源性的飼養(yǎng)層細(xì)胞。胚胎成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞等都被采用作為胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)飼養(yǎng)層,但其來源有悖于倫理道德或需經(jīng)過婦科手術(shù)等而受到嚴(yán)格限制。包皮來源廣泛,取材方便,國內(nèi)外已有采用人包皮成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblasts,HFF)作飼養(yǎng)層成功培養(yǎng)人ES細(xì)胞的報道,但還未見用其作為人EG細(xì)胞飼養(yǎng)層的報道。故我們采用包皮成纖維細(xì)胞作為人EG細(xì)胞體外培養(yǎng)的飼養(yǎng)層,進行了以下研究:1.以包皮環(huán)切術(shù)后兒童包皮為材料分離、培養(yǎng)、鑒定包皮成纖維細(xì)胞,并研究其生物學(xué)特性。2.以自行分離培養(yǎng)的包皮成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層,分離培養(yǎng)人EG細(xì)胞,并進行鑒定。 1.包皮成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性研究 目的:研究包皮成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性并檢測其分泌物成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)的量。 方法:取包皮環(huán)切術(shù)后兒童包皮分離、培養(yǎng)包皮成纖維細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測P3代細(xì)胞純度,流式細(xì)胞術(shù)及MTT法檢測P3、P9、P15、P20、P25、P30代細(xì)胞的細(xì)胞周期、生長曲線,MTT法測定不同濃度絲裂霉素C作用不同時間抑制HFF增殖作用及用ELISA法測定P3、P9、P15、P20、P25、P30代細(xì)胞上清液中FGF的量。 結(jié)果: 1.包皮成纖維細(xì)胞呈貼壁生長,形成漩渦狀、柵欄狀或放射狀有序排列,細(xì)胞形態(tài)多樣。 2. P3代細(xì)胞波形蛋白染色顯示成纖維細(xì)胞純度達到95%以上。 3. P3、P9、P15、P20、P25、P30代細(xì)胞的細(xì)胞周期大多數(shù)處于G0/G1期,為細(xì)胞進入S期做準(zhǔn)備。P3、P9、P15、P20、P25、P30代細(xì)胞的生長曲線顯示沒有明顯的滯留期,在1～6d都處于快速增殖期,第7d開始處于平臺期,細(xì)胞周期與細(xì)胞生長曲線保持一致。 4.絲裂霉素C抑制包皮成纖維細(xì)胞增殖的最佳濃度和時間為12.5μg/ml作用2.5h。 5. P3、P9、P15、P20、P25、P30代細(xì)胞上清液中FGF的量在172.09±2.66 pg/ml～245.25±1.66 pg/ml之間波動。 結(jié)論:包皮成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性表明其作為人EG細(xì)胞的飼養(yǎng)層是可行的。 2.包皮成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層對人EG細(xì)胞生長的影響目的:研究人EG細(xì)胞在包皮成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的生長并進行干細(xì)胞生物學(xué)鑒定。 方法:分離5～11w流產(chǎn)胚胎PGCs,種植在包皮成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上并連續(xù)傳代,用堿性磷酸酶試劑盒檢測其堿性磷酸酶活性,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測其胚胎表面特異性抗原SSEA-1、SSEA-4的表達,RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達。 結(jié)果: 1.分離培養(yǎng)的人EG細(xì)胞具有人胚胎干細(xì)胞的典型形態(tài)和集落生長特征。 2. P3代人EG細(xì)胞集落AKP染色呈強陽性。 3. P3代人EG細(xì)胞集落胚胎階段特異性抗原SSEA-1、SSEA-4表達陽性。 4. P3代人EG細(xì)胞集落轉(zhuǎn)錄因子Oct-4表達陽性。 結(jié)論:包皮成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層能支持人EG細(xì)胞的生長并維持其未分化狀態(tài)。 綜上所述,本實驗研究了包皮成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性及人EG細(xì)胞在人包皮成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的生長狀況,為人EG細(xì)胞的進一步研究進行了有益的探索。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 劉永剛;李芳菲;陳地龍;王莎莉;王亞平;;以STO細(xì)胞和hELF作為胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)飼養(yǎng)層的比較[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2006年18期

2 石敏,謝常青,盧光t;小鼠胚胎成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)組學(xué)初步分析[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年01期

3 陳永珍;李芳;陳謙;余水長;朱e，

本文編號：2425909