【摘要】： 目的 脊柱融合術(shù)是目前骨科醫(yī)生常用的術(shù)式之一,但融合失敗率較高。目前設(shè)計(jì)的內(nèi)固定器械可以保證脊柱的即刻穩(wěn)定性,提供植骨融合所需的力學(xué)環(huán)境,但脊柱的長(zhǎng)期穩(wěn)定最終還要依靠骨性融合。脊柱融合術(shù)中自體骨移植通常被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”,但是脊柱融合需要較大的植骨量而自體骨來(lái)源有限,并且會(huì)對(duì)供體造成新的損害,常會(huì)伴有供區(qū)疼痛、神經(jīng)損傷、骨折、感染等并發(fā)癥。而異體骨具有免疫原性,而且存在傳染疾病等潛在危險(xiǎn)。影響脊柱骨性融合的因素有很多,許多研究希望通過(guò)尋找高性能的自體骨替代材料促進(jìn)脊柱融合。由支架材料、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子復(fù)合構(gòu)建的組織工程骨作為一種理想的自體骨組織替代物,有希望通過(guò)骨誘導(dǎo)方式促進(jìn)脊柱融合,成為目前骨科研究熱點(diǎn)之一。 我們采用Ⅰ型膠原酶消化法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合,對(duì)存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose mesenchymal stem cell,ADSC)進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)和體外擴(kuò)增,運(yùn)用免疫表型和誘導(dǎo)分化相結(jié)合的方法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染將BMP-7基因轉(zhuǎn)入ADSCs,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過(guò)BMP-7基因轉(zhuǎn)染ADSCs促使其向成骨細(xì)胞分化,并過(guò)測(cè)定Ⅰ型膠原是否穩(wěn)定表達(dá)來(lái)判斷,為探索一種具有成骨誘導(dǎo)生物活性、促進(jìn)脊柱融合的自體骨替代新材料奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 新西蘭大白兔,中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。 二、實(shí)驗(yàn)方法 (一)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 1、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 采用Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法,分離、純化兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。 2、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 CD_(44)、CD_(49d)、CD_(106)檢測(cè)細(xì)胞免疫表型。 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo):10~(-8)mol/L地塞米松、50μmol/L-抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的成骨誘導(dǎo)液中。 3、生物學(xué)性狀的觀(guān)察 用倒置顯微鏡每日觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并拍照。繪制第2代ADSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 (二)BMP-7基因轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 1、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7的重構(gòu)、擴(kuò)增純化及鑒定。 2、建立穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-BMP-7-ADSCs細(xì)胞株,RT-PCR檢測(cè)BMP-7表達(dá)。 3、相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并免疫熒光檢測(cè)Ⅰ型膠原的表達(dá)。 結(jié)果 (一)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)成功 1、Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織后所分離得到的細(xì)胞大多為圓形單個(gè)核細(xì)胞,貼壁生長(zhǎng)后原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。各代細(xì)胞形態(tài)基本一致,都為長(zhǎng)梭形。 2、細(xì)胞免疫表型檢測(cè)細(xì)胞膜表達(dá)CD_(44)、CD_(49d)陽(yáng)性而CD_(106)的表達(dá)為陰性。地塞米松、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)組ALP、茜素紅染色呈陽(yáng)性。 3、繪制第2代ADSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn),通過(guò)分析可以看出ADSCs的增殖符合干細(xì)胞增殖規(guī)律,其增殖速度較快。 (二)通過(guò)BMP-7基因誘導(dǎo),ADSCs成功誘導(dǎo)分化成骨樣細(xì)胞 1、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7重構(gòu)、擴(kuò)增純化及鑒定成功。 2、成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7-ADSCs細(xì)胞株。 3、BMP-7基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞仍具有較高的增殖能力。 4、BMP-7基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)Ⅰ型膠原,且表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量增高。 結(jié)論 1、通過(guò)Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法在體外能夠成功培養(yǎng)出增殖能力強(qiáng)的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,可以作為組織工程的種子細(xì)胞。 2、經(jīng)BMP-7基因修飾后的ADSCs能夠穩(wěn)定表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白。
[Abstract]:Purpose Spinal fusion is one of the most commonly used procedures of the orthopaedic surgeon, but the failure rate of fusion High. The currently designed internal fixation device can ensure the immediate stability of the spine, provide the mechanical environment for bone fusion, but the long-term stability of the spine ultimately depends on the bone Fusion. Autograft in spinal fusion is generally considered to be a 鈥済old standard鈥，

本文編號(hào)：2421778