發(fā)布時間：2019-02-13 17:23

【摘要】： 目的 脊柱融合術(shù)是目前骨科醫(yī)生常用的術(shù)式之一,但融合失敗率較高。目前設(shè)計的內(nèi)固定器械可以保證脊柱的即刻穩(wěn)定性,提供植骨融合所需的力學(xué)環(huán)境,但脊柱的長期穩(wěn)定最終還要依靠骨性融合。脊柱融合術(shù)中自體骨移植通常被認為是“金標準”,但是脊柱融合需要較大的植骨量而自體骨來源有限,并且會對供體造成新的損害,常會伴有供區(qū)疼痛、神經(jīng)損傷、骨折、感染等并發(fā)癥。而異體骨具有免疫原性,而且存在傳染疾病等潛在危險。影響脊柱骨性融合的因素有很多,許多研究希望通過尋找高性能的自體骨替代材料促進脊柱融合。由支架材料、種子細胞和生長因子復(fù)合構(gòu)建的組織工程骨作為一種理想的自體骨組織替代物,有希望通過骨誘導(dǎo)方式促進脊柱融合,成為目前骨科研究熱點之一。 我們采用Ⅰ型膠原酶消化法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合,對存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細胞(adipose mesenchymal stem cell,ADSC)進行分離、純化培養(yǎng)和體外擴增,運用免疫表型和誘導(dǎo)分化相結(jié)合的方法對培養(yǎng)的細胞進行鑒定。通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染將BMP-7基因轉(zhuǎn)入ADSCs,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞,通過BMP-7基因轉(zhuǎn)染ADSCs促使其向成骨細胞分化,并過測定Ⅰ型膠原是否穩(wěn)定表達來判斷,為探索一種具有成骨誘導(dǎo)生物活性、促進脊柱融合的自體骨替代新材料奠定實驗基礎(chǔ)。 材料與方法 一、實驗材料 新西蘭大白兔,中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。 二、實驗方法 (一)兔脂肪間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 1、兔脂肪間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng) 采用Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法,分離、純化兔脂肪間充質(zhì)干細胞,進行體外培養(yǎng)擴增。 2、兔脂肪間充質(zhì)干細胞的鑒定 CD_(44)、CD_(49d)、CD_(106)檢測細胞免疫表型。 向成骨細胞誘導(dǎo):10~(-8)mol/L地塞米松、50μmol/L-抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的成骨誘導(dǎo)液中。 3、生物學(xué)性狀的觀察 用倒置顯微鏡每日觀察細胞的生長情況并拍照。繪制第2代ADSCs細胞生長曲線。 (二)BMP-7基因轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)其向成骨細胞分化的實驗研究 1、真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7的重構(gòu)、擴增純化及鑒定。 2、建立穩(wěn)定表達pcDNA3.1-BMP-7-ADSCs細胞株,RT-PCR檢測BMP-7表達。 3、相差顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)并免疫熒光檢測Ⅰ型膠原的表達。 結(jié)果 (一)兔脂肪間充質(zhì)干細胞分離、純化、培養(yǎng)成功 1、Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織后所分離得到的細胞大多為圓形單個核細胞,貼壁生長后原代細胞及傳代細胞生長狀態(tài)良好。各代細胞形態(tài)基本一致,都為長梭形。 2、細胞免疫表型檢測細胞膜表達CD_(44)、CD_(49d)陽性而CD_(106)的表達為陰性。地塞米松、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)組ALP、茜素紅染色呈陽性。 3、繪制第2代ADSCs細胞生長曲線,通過分析可以看出ADSCs的增殖符合干細胞增殖規(guī)律,其增殖速度較快。 (二)通過BMP-7基因誘導(dǎo),ADSCs成功誘導(dǎo)分化成骨樣細胞 1、真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7重構(gòu)、擴增純化及鑒定成功。 2、成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP-7-ADSCs細胞株。 3、BMP-7基因轉(zhuǎn)染后細胞仍具有較高的增殖能力。 4、BMP-7基因轉(zhuǎn)染后細胞能夠穩(wěn)定表達Ⅰ型膠原,且表達量較未轉(zhuǎn)染組的表達量增高。 結(jié)論 1、通過Ⅰ型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法在體外能夠成功培養(yǎng)出增殖能力強的兔脂肪間充質(zhì)干細胞,可以作為組織工程的種子細胞。 2、經(jīng)BMP-7基因修飾后的ADSCs能夠穩(wěn)定表達Ⅰ型膠原蛋白。
[Abstract]:Purpose Spinal fusion is one of the most commonly used procedures of the orthopaedic surgeon, but the failure rate of fusion High. The currently designed internal fixation device can ensure the immediate stability of the spine, provide the mechanical environment for bone fusion, but the long-term stability of the spine ultimately depends on the bone Fusion. Autograft in spinal fusion is generally considered to be a 鈥済old standard鈥，

本文編號：2421778