【摘要】： [目的]星形膠質(zhì)細胞作為神經(jīng)發(fā)生所必須的小生境中數(shù)量最豐富的細胞,可通過細胞間接觸和分泌可溶性因子調(diào)控神經(jīng)干細胞的增殖和分化。然而,目前對星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生哪些因子參與調(diào)控以及何種因子在其中起重要作用知之甚少。本課題擬通過運用體外細胞培養(yǎng)與干預(yù)、定量蛋白組學技術(shù)和生物信息學方法等,篩選在神經(jīng)干細胞增殖和分化中發(fā)揮主要作用的關(guān)鍵分子并加以驗證。以期通過對關(guān)鍵分子的干預(yù),探索促進未成熟腦損傷修復(fù)的有效途徑,為臨床早產(chǎn)兒腦損傷的治療提供新的思路。 [方法]首先建立新生1日齡大鼠腦紋狀體星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞體外共培養(yǎng)體系,分別采用適度的氧糖剝奪、適宜濃度的布雷福德菌素和氟代檸檬酸抑制星形膠質(zhì)細胞的分泌功能。通過采用BrdU/Nestin和Tuj1/Nestin免疫熒光雙染,觀察共培養(yǎng)下的神經(jīng)干細胞增殖、分化的改變,判斷星形膠質(zhì)細胞的功能狀態(tài)。在成功建立細胞培養(yǎng)和干預(yù)模型的基礎(chǔ)上,收集各組星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清,超濾濃縮后采用iTRAQ標記定量蛋白組學方法和生物信息學分析方法,鑒定不同處理組與對照組上清中差異表達的分泌蛋白,并從中篩選出可能發(fā)揮主要作用的關(guān)鍵分子。對這些關(guān)鍵分子的作用通過已建立的細胞培養(yǎng)體系進一步加以驗證,探討其對神經(jīng)干細胞的作用及其機制。 [結(jié)果]通過星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)干細胞非接觸狀態(tài)下共培養(yǎng),我們證實了星形膠質(zhì)細胞可以通過分泌可溶性因子調(diào)控神經(jīng)干細胞的增殖和分化。分別經(jīng)適度的氧糖剝奪、一定濃度的布雷福德菌素和氟代檸檬酸處理后的星形膠質(zhì)細胞分泌功能被抑制,不再具有促進神經(jīng)干細胞增殖和分化的能力,體外細胞共培養(yǎng)和干預(yù)的實驗?zāi)Ｐ统晒ⅰ?采用iTRAQ標記定量蛋白組學技術(shù)在星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清中共鑒定出375個蛋白,通過三個相互互補的分泌蛋白預(yù)測方法,確認其中有130個分泌蛋白,并且有44個蛋白系首次發(fā)現(xiàn)由星形膠質(zhì)細胞分泌產(chǎn)生的。通過Gene ontology分析,發(fā)現(xiàn)在這130個蛋白中,分別有29個蛋白參與調(diào)控細胞的分化、增殖和凋亡,18個蛋白參與調(diào)控免疫、炎癥防御、神經(jīng)生理過程,29個蛋白屬于細胞外基質(zhì)蛋白。運用Proteinpilot軟件計算,顯示在氧糖剝奪、布雷福德菌素和氟代檸檬酸干預(yù)后分別有27、20、25個蛋白上調(diào)和33個、48個、27個蛋白下調(diào)；其中三個干預(yù)組共同上調(diào)的蛋白有4個,共同下調(diào)的蛋白有10個 在共同變化蛋白中我們選取了4個變化最為顯著的(P0.001)蛋白：Postn(下調(diào))、Psap(下調(diào))、Tptl(上調(diào))和Ppia(上調(diào))進行初步的功能驗證。免疫印跡法檢測結(jié)果顯示這4種候選蛋白在星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清中的濃度變化與iTRAQ蛋白組學檢測的結(jié)果一致。體外細胞培養(yǎng)實驗證實Postn蛋白在加入神經(jīng)干細胞培養(yǎng)體系3天起可顯著的促進神經(jīng)干細胞的增殖(P0.05)。 [結(jié)論]1.星形膠質(zhì)細胞可以通過分泌可溶性因子影響神經(jīng)干細胞的增殖和分化；2.星形膠質(zhì)細胞分泌的130種蛋白主要參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、神經(jīng)發(fā)育、免疫反應(yīng)、以及細胞外基質(zhì)構(gòu)成和營養(yǎng)支持功能；3.Postn蛋白在體外環(huán)境可以促進神經(jīng)干細胞的增殖,可能有助于未成熟腦損傷后的神經(jīng)修復(fù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復(fù)旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 馬思敏;POSTN、OPC及亞低溫治療新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的實驗研究[D];復(fù)旦大學;2012年

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本文編號：2420726