【摘要】： 由擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)引起的腹水病是水產(chǎn)動(dòng)物常見的、危害嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一。由于目前尚無商品化的擬態(tài)弧菌疫苗可供水產(chǎn)動(dòng)物使用,養(yǎng)殖基層控制該病的手段主要是依賴抗菌藥物,但是隨著抗菌藥物的反復(fù)使用,細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,抗菌療效不明顯,常導(dǎo)致患病動(dòng)物大批死亡,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,開展新型高效的擬態(tài)弧菌疫苗的研究迫在眉睫。本研究選擇擬態(tài)弧菌外膜蛋白OmpU為靶標(biāo),應(yīng)用生物信息學(xué)軟件篩選OmpU B細(xì)胞表位和優(yōu)化設(shè)計(jì)多表位串聯(lián)基因的基礎(chǔ)上,通過基因克隆表達(dá)技術(shù)獲得重組多表位蛋白,研究其免疫特性,以篩選出有效的多表位串聯(lián)肽,為研制擬態(tài)弧菌多表位疫苗奠定基礎(chǔ)。 首先,應(yīng)用DNAStar軟件,聯(lián)合采用多種不同方法綜合分析擬態(tài)弧菌外膜蛋白OmpU的二級(jí)結(jié)構(gòu)、柔性區(qū)域、親水性、表面可能性和抗原指數(shù),篩選其優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。7個(gè)優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位以丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸(AAY)接頭進(jìn)行不同順序串聯(lián)組合,優(yōu)化設(shè)計(jì)2個(gè)多表位串聯(lián)基因(ompUepis和ompU2epis)。委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成多表位串聯(lián)基因ompUepis并構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-OmpUepis。以pUC57-OmpUepis為模板,通過PCR方法獲得pUC57-OmpU2epis(即2拷貝OmpUepis)。 其次,分別將ompUepis和ompU2epis基因亞克隆至融合表達(dá)載體pAML-c4x中并進(jìn)行原核表達(dá)。根據(jù)pAML-c4x閱讀框的要求,設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異性引物,以pUC57-OmpUepis為摸板,依次經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切和連接反應(yīng)獲得ompUepis和ompU2epis基因片段,并定向克隆至表達(dá)載體pAML-c4x中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pAML-c4x-OmpUepis和pAML-c4x-OmpU2epis。2個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli TB1,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后,以可溶性形式分別表達(dá)了分子量約為52.4kDa和62.5kDa的重組多表位蛋白MBP-OmpUepis與MBP-OmpU2epis。 最后,采用免疫印跡試驗(yàn)、間接ELISA試驗(yàn)和免疫保護(hù)性試驗(yàn)分析重組多表位蛋白的免疫特性。pAML-c4x-OmpUepis/TB1及pAML-c4x-OmpU2epis/TB1重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,以兔抗MBP血清作為一抗,羊抗兔HRP-IgG為二抗進(jìn)行免疫印跡分析,結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物能與兔抗MBP血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),表明MBP-OmpUepis及MBP-OmpU2epis具有免疫反應(yīng)性。分別以重組多表位蛋白MBP-OmpUepis和MBP-OmpU2epis以及標(biāo)簽蛋白MBP免疫BALB/c小鼠,測(cè)定免疫小鼠血清中特異性抗體水平及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MBP-OmpUepis免疫組和MBP-OmpU2epis免疫組小鼠在首次免疫后14d即可檢測(cè)出特異性抗體,隨著免疫次數(shù)和免疫時(shí)間增加,抗體水平不斷提高,至免疫后第44天抗體水平達(dá)到最高峰,隨后逐漸下降。表明重組蛋白MBP-OmpUepis和MBP-OmpU2epis均具有良好的免疫原性。免疫后第44天,用50 LD50擬態(tài)弧菌HX4株菌液(濃度為108 CFU/mL)人工感染各免疫組小鼠,結(jié)果顯示MBP-OmpUepis免疫組和MBP-OmpU2epis免疫組小鼠的免疫保護(hù)率分別為90%和20%,MBP免疫組和生理鹽水對(duì)照組小鼠全部死亡。表明重組多表位蛋白OmpUepis具有良好的免疫保護(hù)性。 綜上所述,重組多表位蛋白OmpUepis具有良好的抗原性和免疫保護(hù)性,在擬態(tài)弧菌多表位疫苗研制中具有應(yīng)用價(jià)值。
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【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2412260