【摘要】： 目的用人骨形成蛋白-7真核表達(dá)質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-hBMP-7)轉(zhuǎn)染Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs),復(fù)合膠原膜BME-10X體外構(gòu)建組織工程化復(fù)合物,移植修復(fù)犬慢性Ⅱ°根分叉病變,探討hBMP-7基因修飾的BMSCs在牙周組織再生中的作用,為基因治療與組織工程聯(lián)合應(yīng)用于牙周組織缺損再生治療奠定基礎(chǔ)。 方法1.利用DNA重組技術(shù),將hBMP-7片段克隆到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中,EcoRⅠ單酶切、PCR及序列分析鑒定獲得的重組質(zhì)粒;2.貼壁法培養(yǎng)Beagle犬BMSCs,體外應(yīng)用脂質(zhì)體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染,RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及ELISA檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。3.體外基因轉(zhuǎn)染后,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,MTT法描繪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,TUNEL和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡,檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)及鈣化結(jié)節(jié)等成骨細(xì)胞表型。4.轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞與膠原膜BME-10X復(fù)合,通過(guò)熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡及組織學(xué)進(jìn)行觀察。5.人工構(gòu)建5只Beagle犬慢性Ⅱ度根分叉病變模型,將轉(zhuǎn)染目的基因的BMSCs與未轉(zhuǎn)染BMSCs分別以1×107個(gè)/mL接種于膠原膜BME-10X,植入牙周缺損內(nèi),12周后取材作病理切片,H.E染色觀察牙周組織再生情況,測(cè)量新生牙骨質(zhì)長(zhǎng)度百分比和新生牙槽骨面積百分比,結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果1.hBMP-7被定向插入到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中。2.通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)成功地對(duì)Beagle犬BMSCs進(jìn)行了pIRES2-EGFP-hBMP-7瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,24h后即可見(jiàn)到轉(zhuǎn)染的部分細(xì)胞發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率為17%-31%。RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色和ELISA檢測(cè)表明,hBMP-7在BMSCs中得到了有效表達(dá)。3.目的基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)略有變化,增殖能力無(wú)明顯改變,凋亡率無(wú)明顯變化,堿性磷酸酶活性明顯增高,骨鈣素表達(dá)增強(qiáng),鈣化結(jié)節(jié)增大。4.轉(zhuǎn)染細(xì)胞復(fù)合膠原膜后生長(zhǎng)良好,24h細(xì)胞已貼附、伸展,并復(fù)層生長(zhǎng)。透射電鏡可見(jiàn)細(xì)胞與材料表面連接緊密,包膜部分增厚,形成類(lèi)似半橋粒樣結(jié)構(gòu)。5.各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均可見(jiàn)不同程度的牙周組織再生,轉(zhuǎn)染細(xì)胞復(fù)合膠原膜組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞復(fù)合膠原膜組的新生牙槽骨面積百分比和新生牙骨質(zhì)長(zhǎng)度百分比與單純材料組相比有明顯增加(P0.05);轉(zhuǎn)染細(xì)胞復(fù)合膠原膜組新生牙槽骨面積百分比與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞復(fù)合膠原膜組相互比較差異有顯著性(P0.05);而其新生牙骨質(zhì)長(zhǎng)度百分比與之相比無(wú)顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論1.利用基因工程原理成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hBMP-7。 2.hBMP-7基因可在BMSCs中有效表達(dá)。 3. hBMP-7基因轉(zhuǎn)染可以加速BMSCs向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,hBMP-7基因轉(zhuǎn)染的BMSCs有望成為牙周組織工程理想的種子細(xì)胞。 4. hBMP-7基因轉(zhuǎn)染BMSCs在膠原膜BME-10X上生長(zhǎng)良好,hBMP-7基因轉(zhuǎn)染的BMSCs與膠原膜復(fù)合物有望應(yīng)用于牙周組織工程。 5. hBMP-7基因強(qiáng)化的組織工程技術(shù)是修復(fù)牙周組織缺損的一種較好的方法,有很好的臨床應(yīng)用前景。
[Abstract]:Objective to construct tissue engineering complex (TEC) by transfection of human bone morphogenetic protein-7 eukaryotic expression plasmid (pIRES2-EGFP-hBMP-7) into Beagle canine bone marrow stromal cells (BMSCs) combined with collagen membrane BME-10X (BME-10X), and to repair canine chronic 鈪，

本文編號(hào)：2412199