【摘要】： 第一部分脂聯(lián)素基因敲除小鼠動脈鈣化病理特征性觀察 目的 觀察脂聯(lián)素基因敲除鼠組織病理學和組織化學的特性。 方法 40只6W齡小鼠隨機分為5組(n=8),包括16只脂聯(lián)素基因敲除鼠和野生型鼠24只。分別給予(前4組)高脂高糖膳食飼料和普通膳食,第5組腹腔注射鏈脲菌素1次(30mg/kg)再高脂高糖膳食喂養(yǎng)構(gòu)建2型糖尿病模型鼠。10W后安樂死處死動物,摘眼球取血,分離血漿,采用酶法測定血糖濃度,放射免疫法測定血胰島素水平。分離鼠胸主動脈置4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,行茜素紅鈣化染色。分離主動脈弓到髂骨分支的動脈,用比色法測定10%甲酸抽提的鈣含量。超聲破碎胸主動脈,離心后取上清液采用對硝基苯酚法測定ALP活性。用Bradford法測總蛋白含量。Western-blot檢測Run x2蛋白表達。 結(jié)果 高脂高糖膳食喂養(yǎng)條件下,脂聯(lián)素基因敲除鼠與鏈脲菌素干預鼠的血糖、血胰島素水平明顯高于野生型鼠。敲除鼠出現(xiàn)了嚴重的動脈鈣化。脂聯(lián)素基因敲除鼠動脈鈣含量明顯高于野生型鼠和鏈脲菌素干預鼠。與普通膳食身高喂養(yǎng)的小鼠比較,高脂高糖膳食組鼠ALP活性升高,敲除鼠升高更為明顯。Runx2蛋白的表達脂聯(lián)素基因敲除鼠明顯高于野生鼠。 結(jié)論 在高脂高糖膳食喂養(yǎng)條件下,脂聯(lián)素基因敲除鼠出現(xiàn)嚴重的2型糖尿病性動脈鈣化,其機制可能與動脈中升高的ALP活性和Runx2蛋白的表達有關。 第二部分脂聯(lián)素對鈣化的血管平滑肌的影響 目的 探討體外培養(yǎng)的鈣化血管平滑肌細胞中脂聯(lián)素受體的表達及其用重組脂聯(lián)素干預后對鈣化血管平滑肌的影響。 方法 剖殺用高脂高糖飲食喂養(yǎng)10W脂聯(lián)素基因敲除鼠,分離主動脈行鈣化動脈平滑肌細胞培養(yǎng),應用免疫細胞化學方法鑒定血管平滑肌細胞。應用PT-PCR和Western-blot分別測定脂聯(lián)素受體mRNA和蛋白在鈣化血管平滑肌細胞中的表達情況。取不同濃度的(0,3,10,30μg/mL)脂聯(lián)素干預鈣化的血管平滑肌細胞48h,采用對硝基苯酚法測定堿性磷酸酶(ALP)活性,放射免疫法檢測骨鈣素(OC)含量,Western-blot檢測Runx2蛋白的表達。用30μg/mL的脂聯(lián)素干預20d后,1%茜素紅進行鈣化結(jié)節(jié)染色。 結(jié)果 鈣化血管平滑肌細胞α-肌動蛋白(a-actin)的免疫細胞化學染色證定培養(yǎng)細胞為血管平滑肌細胞,且該細胞能自發(fā)形成鈣化結(jié)節(jié)。鈣化的平滑肌細胞主要表達脂聯(lián)素受體R1 mRNA和蛋白。脂聯(lián)素干預能使鈣化的血管平滑肌細胞ALP活性降低,OC分泌減少,Runx2蛋白表達下降,并且呈劑量依賴關系。用30μg/mL脂聯(lián)素干預20d后,鈣化血管平滑肌細胞的鈣化結(jié)節(jié)得到顯著抑制。 結(jié)論 脂聯(lián)素能抑制培養(yǎng)的鈣化血管平滑肌細胞的鈣化,其機制可能通過與鈣化血管平滑肌細胞表達AdipoR1結(jié)合發(fā)揮作用。 第三部分脂聯(lián)素通過AdpoRl/p38信號途徑抑制CVSMCs體外成骨樣鈣化 目的 探討脂聯(lián)素抑制脂聯(lián)素基因敲除鼠鈣化血管平滑肌細胞體外成骨樣鈣化的作用機制。 方法 用30μg/mL脂聯(lián)素干預鈣化血管平滑肌細胞,0、5、30、60min后抽提細胞總蛋白,用Western-blot方法檢測細胞傳導信號p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK蛋白在細胞內(nèi)的表達。合成脂聯(lián)素受體R1的小干擾RNA (AdipoRl-SiRNAs)抑制AdipoRl表達,觀察AdipoR1、p-p38和p38蛋白在鈣化血管平滑肌細胞的表達。加入p38信號傳導抑制劑SB203580,聯(lián)合AdipoRl-SiRNAs,用對硝基苯酚法測定鈣化血管平滑肌細胞堿性磷酸酶(ALP)的活性。 結(jié)果 脂聯(lián)素可誘導鈣化血管平滑肌細胞p38磷酸化,但對JNK和ERK的激活無作用。SiRNAs-AdipoRl轉(zhuǎn)染可阻斷AdipoRl表達,可抑制p38磷酸化。p38抑制劑SB203580和SiRNAs-AdipoR1可減弱脂聯(lián)素對鈣化血管平滑肌細胞ALP活性的影響。說明p38信號通路在脂聯(lián)素抑制鈣化血管平滑肌細胞的鈣化中起重要作用。 結(jié)論 脂聯(lián)素可通過AdipoR1/p38信號途徑抑制鈣化血管平滑肌細胞體外成骨樣鈣化。
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2409460