【摘要】： 第一章:促P19鼠胚癌細胞分化神經(jīng)元樣細胞活性篩選方法構建 1.Tubulin alphaⅠ穩(wěn)定轉染P19鼠胚癌(P19 embryonal carcinoma,P19)細胞分化神經(jīng)元樣細胞應用研究 目的:建立Tubulin alphaⅠ(Tα1)穩(wěn)定轉染P19細胞系,構建體外經(jīng)誘導分化為神經(jīng)元樣細胞模型,以用于高效快速篩選化合物促神經(jīng)分化活性。方法:借助陽離子脂質體轉染法,將構建的質粒Tα1-PGL4.17[luc2/Neo]Vector轉染至P19細胞中,經(jīng)G418篩選,陽性克隆傳代培養(yǎng)。經(jīng)轉染的P19細胞,當神經(jīng)分化Neo基因表達啟動時,用熒光素酶檢測呈熒光,熒光強度與分化神經(jīng)元樣細胞成正比。設計不同濃度RA誘導分化為神經(jīng)元樣細胞適用性試驗,并以DMSO作對照。96孔板貼壁2天后用熒光素酶試劑盒分別檢測其熒光值,觀察該轉染細胞是否可用于大量化合物活性篩選。結果:RA組貼壁后分化的表型明顯優(yōu)于DMSO組和空白組,但重復實驗數(shù)據(jù)欠穩(wěn)定,未轉染細胞組熒光值雖正常(為零);但陽性對照RA組比陰性對照DMSO組和空白對照組都低,且隨著貼壁時間增長,熒光值有逐漸降低的趨勢。結論:初步建立了Tubulin alphaⅠ穩(wěn)定轉染P19細胞的體系,但在用于化合物誘導分化神經(jīng)元樣細胞活性篩選中,適用性欠理想,亟待建立更優(yōu)化的評價體系。 2.P19細胞FM1-43FX染料熒光染色法評價分化神經(jīng)元樣細胞應用研究 目的:探索P19細胞分化為神經(jīng)元樣細胞FM1-43FX染料特異性熒光染色,構建誘導分化為神經(jīng)元樣細胞高效快速篩選化合物模型。方法:根據(jù)FM1-43FX染料可結合于細胞膜,通過高K離子誘導神經(jīng)細胞動作電位,隨神經(jīng)囊泡重攝取過程而進入細胞內,故可特異性針對有囊泡重攝取功能神經(jīng)細胞進行染色的原理,測得的熒光強度與P19細胞分化神經(jīng)元樣細胞成正比。設RA為陽性對照,DMSO為陰性對照,構建適宜于化合物誘導分化神經(jīng)元樣細胞評價方法。96孔板設6個濃度,貼壁培養(yǎng)2,4,6和8天,分別探索RA在該體系促神經(jīng)分化的最佳時間和最佳濃度。另在同塊板上洗去染料后,以MTT法評價細胞增殖情況,避免因死亡細胞吸附熒光染料所致的假陽性。結果:P19細胞貼壁培養(yǎng)4天開始兩組間熒光定量即存在統(tǒng)計學差異,但相差顯微鏡未顯示形態(tài)學呈顯著軸突形成。貼壁培養(yǎng)6天后,相差顯微鏡顯示RA處理組細胞形成神經(jīng)元樣形態(tài),但FM1-43FX染色熒光成像尚未能充分體現(xiàn)。貼壁培養(yǎng)8天后,不僅熒光定量顯著增強,而且相差顯微和熒光顯微均體現(xiàn)明顯的軸突形成,提示適宜于篩選用。MTT結果顯示誘導過程中藥物均無顯著毒性作用,5×10~(-7)mol/LRA為最佳促神經(jīng)分化濃度。結論:FM1-43FX熒光染色法可用于神經(jīng)元樣細胞特異性染色。P19細胞貼壁培養(yǎng)8天后所獲熒光強度最大,且測得熒光值與神經(jīng)元樣細胞表型高度一致。本研究成功構建高效快速促神經(jīng)分化初步篩選方法。 第二章黃酮類化合物庫內小分子促神經(jīng)分化活性篩選 1.P19細胞FM1-43FX熒光染色法評價促神經(jīng)分化初級篩選 目的:采用P19細胞體外定向分化為神經(jīng)元樣細胞熒光染色法技術,結合MTT實驗,對黃酮類化合物庫內30個小分子進行促神經(jīng)分化活性評價。方法:黃酮類化合物根據(jù)結構分為a、b、c三個系列,每個系列各10個化合物。5×10~(-7) mol/L RA為陽性對照,DMSO為陰性對照。P19細胞以1×10~5 cells/ml的密度加供試化合物懸浮培養(yǎng)4天,懸浮培養(yǎng)液為:90%α-MEM+10%進口胎牛血清,懸浮完畢,收集聚集的擬胚體用0.25%的胰蛋白酶和D-Hanks以1:5的比例在37℃孵箱內消化5min后離心計數(shù),以1×10~6 cells/ml的密度貼壁培養(yǎng),培養(yǎng)液為:95%α-MEM+5%胎牛血清,96孔板貼壁培養(yǎng),每2～3天換一次液。采用FM1-43FX染料熒光染色法測定評價結果。同時結合MTT實驗評價細胞增殖情況,避免假陽性。結果:1a、4a、5a、3'a、4'a、5'a、3b、5c等8個化合物呈現(xiàn)促神經(jīng)分化活性,熒光強度分別具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05,P＜0.01)。MTT結果顯示8個化合物均未抑制細胞增殖。結論:(1) P19細胞定向分化為神經(jīng)元樣細胞表型和熒光強度具有一致性,該體系可用于促神經(jīng)元樣細胞形成化合物活性篩選。(2) 1a、4a、5a、3'a、4'a、5'a、3b、5c此8個化合物有促P19神經(jīng)分化活性,且不具有細胞毒性。(3) a'系列化合物呈現(xiàn)8位取代構效關系,隨著8位取代側鏈的增長,熒光值增大,提示8位取代碳原子數(shù)與促神經(jīng)細胞形成活性呈一定的正比關系。 2.胚胎干細胞神經(jīng)形成表型篩選 目的:利用促胚胎干(Embryonic stem,ES)細胞定向分化神經(jīng)元樣細胞4-/4+法,進一步確定初篩活性化合物的促神經(jīng)分化作用,以期發(fā)現(xiàn)促神經(jīng)再生先導化合物。方法:經(jīng)P19細胞初篩呈陽性結果的8個化合物,按照4-/4+法進一步評價促小鼠ES細胞定向分化神經(jīng)元樣細胞作用。相差顯微鏡初步評價具有軸突和胞體的神經(jīng)元,以軸突為胞體3-5倍長初步定為神經(jīng)元表型形成。再以免疫熒光成像分析β-TubulinⅢ陽性表達細胞確認,流式細胞術定量比較分化率。結果:相差顯微鏡和免疫熒光成像分析,經(jīng)P19細胞初篩所獲的8個活性化合物均可促進ES細胞β-TubulinⅢ陽性表達,其中4a化合物效果最佳;初篩結果中不具有促神經(jīng)分化活性的兩個化合物1c、5'c則幾乎無β-TubulinⅢ陽性表達。ES細胞免疫熒光成像的結果與P19細胞篩選結果基本吻合。流式細胞術定量比較結果顯示:陰性對照組DMSO陽染細胞略微偏高,但與陽性對照RA組相比有一定的差異,供試藥物組結果與免疫熒光成像的結果基本吻合。結論:(1)經(jīng)ES細胞次級篩選,4a、5c兩個化合物有較好的促神經(jīng)分化作用,而5'c則幾乎不具有此作用。(2)該化合物構效關系分析顯示:1、甲氧基的神經(jīng)誘導活性強于羥基;2、4'位取代會減弱其神經(jīng)誘導活性。 第三章黃酮類化合物促神經(jīng)元樣細胞分化與微管蛋白表達關聯(lián)性研究 目的:探索化合物4a是否經(jīng)由上調三個神經(jīng)元呈特征性表達的細胞骨架蛋白:微管相關蛋白2(MAP2)、神經(jīng)絲蛋白(NEFM)、α-TubulinⅢ而促ES細胞定向分化神經(jīng)元樣細胞,由此獲得可能存在的信號通路/分子事件。方法:采用經(jīng)典的擬配體4-/4+法模擬體內胚胎發(fā)育狀態(tài),形成擬配體,進而貼壁向神經(jīng)元樣細胞分化。利用western blot法評價神經(jīng)元呈特征性表達的三個細胞骨架蛋白:微管相關蛋白2(MAP2)、神經(jīng)絲蛋白(NEFM)和微管蛋白(β-TubulinⅢ)的表達水平,作為藥物促ES細胞定向分化神經(jīng)元指標。結果:陰性對照組DMSO和陽性對照組RA,三個骨架蛋白的表達均存在一定的時間發(fā)育依賴性,隨著貼壁培養(yǎng)時間的增長,表達上調;而對于化合物4a,NEFM和β-TubulinⅢ兩個骨架蛋白的表達也存在一定的時間發(fā)育依賴性,但是MAP2蛋白表達呈一定的下降趨勢。結論:化合物4a可能是經(jīng)由上調NEFM和β-TubulinⅢ這兩個神經(jīng)元呈特征性表達的細胞骨架蛋白而促ES細胞定向分化神經(jīng)元樣細胞的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：2405953