【摘要】： 第一章:促P19鼠胚癌細(xì)胞分化神經(jīng)元樣細(xì)胞活性篩選方法構(gòu)建 1.Tubulin alphaⅠ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P19鼠胚癌(P19 embryonal carcinoma,P19)細(xì)胞分化神經(jīng)元樣細(xì)胞應(yīng)用研究 目的:建立Tubulin alphaⅠ(Tα1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞系,構(gòu)建體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞模型,以用于高效快速篩選化合物促神經(jīng)分化活性。方法:借助陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將構(gòu)建的質(zhì)粒Tα1-PGL4.17[luc2/Neo]Vector轉(zhuǎn)染至P19細(xì)胞中,經(jīng)G418篩選,陽(yáng)性克隆傳代培養(yǎng)。經(jīng)轉(zhuǎn)染的P19細(xì)胞,當(dāng)神經(jīng)分化Neo基因表達(dá)啟動(dòng)時(shí),用熒光素酶檢測(cè)呈熒光,熒光強(qiáng)度與分化神經(jīng)元樣細(xì)胞成正比。設(shè)計(jì)不同濃度RA誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞適用性試驗(yàn),并以DMSO作對(duì)照。96孔板貼壁2天后用熒光素酶試劑盒分別檢測(cè)其熒光值,觀察該轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否可用于大量化合物活性篩選。結(jié)果:RA組貼壁后分化的表型明顯優(yōu)于DMSO組和空白組,但重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)欠穩(wěn)定,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組熒光值雖正常(為零);但陽(yáng)性對(duì)照RA組比陰性對(duì)照DMSO組和空白對(duì)照組都低,且隨著貼壁時(shí)間增長(zhǎng),熒光值有逐漸降低的趨勢(shì)。結(jié)論:初步建立了Tubulin alphaⅠ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞的體系,但在用于化合物誘導(dǎo)分化神經(jīng)元樣細(xì)胞活性篩選中,適用性欠理想,亟待建立更優(yōu)化的評(píng)價(jià)體系。 2.P19細(xì)胞FM1-43FX染料熒光染色法評(píng)價(jià)分化神經(jīng)元樣細(xì)胞應(yīng)用研究 目的:探索P19細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞FM1-43FX染料特異性熒光染色,構(gòu)建誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞高效快速篩選化合物模型。方法:根據(jù)FM1-43FX染料可結(jié)合于細(xì)胞膜,通過(guò)高K離子誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位,隨神經(jīng)囊泡重?cái)z取過(guò)程而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),故可特異性針對(duì)有囊泡重?cái)z取功能神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行染色的原理,測(cè)得的熒光強(qiáng)度與P19細(xì)胞分化神經(jīng)元樣細(xì)胞成正比。設(shè)RA為陽(yáng)性對(duì)照,DMSO為陰性對(duì)照,構(gòu)建適宜于化合物誘導(dǎo)分化神經(jīng)元樣細(xì)胞評(píng)價(jià)方法。96孔板設(shè)6個(gè)濃度,貼壁培養(yǎng)2,4,6和8天,分別探索RA在該體系促神經(jīng)分化的最佳時(shí)間和最佳濃度。另在同塊板上洗去染料后,以MTT法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況,避免因死亡細(xì)胞吸附熒光染料所致的假陽(yáng)性。結(jié)果:P19細(xì)胞貼壁培養(yǎng)4天開(kāi)始兩組間熒光定量即存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但相差顯微鏡未顯示形態(tài)學(xué)呈顯著軸突形成。貼壁培養(yǎng)6天后,相差顯微鏡顯示RA處理組細(xì)胞形成神經(jīng)元樣形態(tài),但FM1-43FX染色熒光成像尚未能充分體現(xiàn)。貼壁培養(yǎng)8天后,不僅熒光定量顯著增強(qiáng),而且相差顯微和熒光顯微均體現(xiàn)明顯的軸突形成,提示適宜于篩選用。MTT結(jié)果顯示誘導(dǎo)過(guò)程中藥物均無(wú)顯著毒性作用,5×10~(-7)mol/LRA為最佳促神經(jīng)分化濃度。結(jié)論:FM1-43FX熒光染色法可用于神經(jīng)元樣細(xì)胞特異性染色。P19細(xì)胞貼壁培養(yǎng)8天后所獲熒光強(qiáng)度最大,且測(cè)得熒光值與神經(jīng)元樣細(xì)胞表型高度一致。本研究成功構(gòu)建高效快速促神經(jīng)分化初步篩選方法。 第二章黃酮類(lèi)化合物庫(kù)內(nèi)小分子促神經(jīng)分化活性篩選 1.P19細(xì)胞FM1-43FX熒光染色法評(píng)價(jià)促神經(jīng)分化初級(jí)篩選 目的:采用P19細(xì)胞體外定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞熒光染色法技術(shù),結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn),對(duì)黃酮類(lèi)化合物庫(kù)內(nèi)30個(gè)小分子進(jìn)行促神經(jīng)分化活性評(píng)價(jià)。方法:黃酮類(lèi)化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)分為a、b、c三個(gè)系列,每個(gè)系列各10個(gè)化合物。5×10~(-7) mol/L RA為陽(yáng)性對(duì)照,DMSO為陰性對(duì)照。P19細(xì)胞以1×10~5 cells/ml的密度加供試化合物懸浮培養(yǎng)4天,懸浮培養(yǎng)液為:90%α-MEM+10%進(jìn)口胎牛血清,懸浮完畢,收集聚集的擬胚體用0.25%的胰蛋白酶和D-Hanks以1:5的比例在37℃孵箱內(nèi)消化5min后離心計(jì)數(shù),以1×10~6 cells/ml的密度貼壁培養(yǎng),培養(yǎng)液為:95%α-MEM+5%胎牛血清,96孔板貼壁培養(yǎng),每2～3天換一次液。采用FM1-43FX染料熒光染色法測(cè)定評(píng)價(jià)結(jié)果。同時(shí)結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況,避免假陽(yáng)性。結(jié)果:1a、4a、5a、3'a、4'a、5'a、3b、5c等8個(gè)化合物呈現(xiàn)促神經(jīng)分化活性,熒光強(qiáng)度分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)。MTT結(jié)果顯示8個(gè)化合物均未抑制細(xì)胞增殖。結(jié)論:(1) P19細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞表型和熒光強(qiáng)度具有一致性,該體系可用于促神經(jīng)元樣細(xì)胞形成化合物活性篩選。(2) 1a、4a、5a、3'a、4'a、5'a、3b、5c此8個(gè)化合物有促P19神經(jīng)分化活性,且不具有細(xì)胞毒性。(3) a'系列化合物呈現(xiàn)8位取代構(gòu)效關(guān)系,隨著8位取代側(cè)鏈的增長(zhǎng),熒光值增大,提示8位取代碳原子數(shù)與促神經(jīng)細(xì)胞形成活性呈一定的正比關(guān)系。 2.胚胎干細(xì)胞神經(jīng)形成表型篩選 目的:利用促胚胎干(Embryonic stem,ES)細(xì)胞定向分化神經(jīng)元樣細(xì)胞4-/4+法,進(jìn)一步確定初篩活性化合物的促神經(jīng)分化作用,以期發(fā)現(xiàn)促神經(jīng)再生先導(dǎo)化合物。方法:經(jīng)P19細(xì)胞初篩呈陽(yáng)性結(jié)果的8個(gè)化合物,按照4-/4+法進(jìn)一步評(píng)價(jià)促小鼠ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)元樣細(xì)胞作用。相差顯微鏡初步評(píng)價(jià)具有軸突和胞體的神經(jīng)元,以軸突為胞體3-5倍長(zhǎng)初步定為神經(jīng)元表型形成。再以免疫熒光成像分析β-TubulinⅢ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞確認(rèn),流式細(xì)胞術(shù)定量比較分化率。結(jié)果:相差顯微鏡和免疫熒光成像分析,經(jīng)P19細(xì)胞初篩所獲的8個(gè)活性化合物均可促進(jìn)ES細(xì)胞β-TubulinⅢ陽(yáng)性表達(dá),其中4a化合物效果最佳;初篩結(jié)果中不具有促神經(jīng)分化活性的兩個(gè)化合物1c、5'c則幾乎無(wú)β-TubulinⅢ陽(yáng)性表達(dá)。ES細(xì)胞免疫熒光成像的結(jié)果與P19細(xì)胞篩選結(jié)果基本吻合。流式細(xì)胞術(shù)定量比較結(jié)果顯示:陰性對(duì)照組DMSO陽(yáng)染細(xì)胞略微偏高,但與陽(yáng)性對(duì)照RA組相比有一定的差異,供試藥物組結(jié)果與免疫熒光成像的結(jié)果基本吻合。結(jié)論:(1)經(jīng)ES細(xì)胞次級(jí)篩選,4a、5c兩個(gè)化合物有較好的促神經(jīng)分化作用,而5'c則幾乎不具有此作用。(2)該化合物構(gòu)效關(guān)系分析顯示:1、甲氧基的神經(jīng)誘導(dǎo)活性強(qiáng)于羥基;2、4'位取代會(huì)減弱其神經(jīng)誘導(dǎo)活性。 第三章黃酮類(lèi)化合物促神經(jīng)元樣細(xì)胞分化與微管蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性研究 目的:探索化合物4a是否經(jīng)由上調(diào)三個(gè)神經(jīng)元呈特征性表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白:微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、神經(jīng)絲蛋白(NEFM)、α-TubulinⅢ而促ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)元樣細(xì)胞,由此獲得可能存在的信號(hào)通路/分子事件。方法:采用經(jīng)典的擬配體4-/4+法模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育狀態(tài),形成擬配體,進(jìn)而貼壁向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。利用western blot法評(píng)價(jià)神經(jīng)元呈特征性表達(dá)的三個(gè)細(xì)胞骨架蛋白:微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、神經(jīng)絲蛋白(NEFM)和微管蛋白(β-TubulinⅢ)的表達(dá)水平,作為藥物促ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)元指標(biāo)。結(jié)果:陰性對(duì)照組DMSO和陽(yáng)性對(duì)照組RA,三個(gè)骨架蛋白的表達(dá)均存在一定的時(shí)間發(fā)育依賴性,隨著貼壁培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),表達(dá)上調(diào);而對(duì)于化合物4a,NEFM和β-TubulinⅢ兩個(gè)骨架蛋白的表達(dá)也存在一定的時(shí)間發(fā)育依賴性,但是MAP2蛋白表達(dá)呈一定的下降趨勢(shì)。結(jié)論:化合物4a可能是經(jīng)由上調(diào)NEFM和β-TubulinⅢ這兩個(gè)神經(jīng)元呈特征性表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白而促ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)元樣細(xì)胞的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R329
【共引文獻(xiàn)】
相關(guān)期刊論文 前10條
1 江和碧,卓本慧,代英,瞿平,李廷玉;bFGF促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化及機(jī)制[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年02期
2 孫燕,史小林;胚胎源性干細(xì)胞分化研究的現(xiàn)狀[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè);2005年02期
3 王圣;劉宇飛;曲鵬;;纈沙坦與螺內(nèi)酯對(duì)腎血管性高血壓大鼠心肌中TGF-β_1表達(dá)的影響[J];海南醫(yī)學(xué);2011年03期
4 孫燕;;小鼠原始生殖細(xì)胞定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的研究[J];海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2009年07期
5 步雪峰;嚴(yán)玉蘭;劉洋;張志堅(jiān);王穆斌;;大鼠骨髓來(lái)源的平滑肌祖細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2008年11期
6 張偉;曾園山;吳武田;陳雅云;陳穗君;;體外誘導(dǎo)的皮膚源性神經(jīng)干細(xì)胞在大鼠受損傷脊髓內(nèi)的存活、分化和遷移[J];解剖學(xué)報(bào);2006年03期
7 李榮平;季鳳清;孫海梅;王屹;曾曉蓓;趙春禮;楊慧;李雪梅;賈曉芳;;人臍血干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)研究[J];解剖學(xué)報(bào);2007年02期
8 郭勇;張西正;魏嚴(yán);張永紅;李瑞欣;;間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2008年01期
9 孫曉冬;徐淼;;淫羊藿苷誘導(dǎo)鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的作用[J];牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2014年02期
10 楊躍武,杭燕南,孫大金;地氟醚預(yù)處理對(duì)心肌損傷與修復(fù)的影響[J];上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年04期
相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條
1 江偉;VitA在缺氧缺血腦損傷中的作用及機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年
2 程映華;神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的組織工程學(xué)研究[D];蘇州大學(xué);2002年
3 田建偉;阿伐他汀調(diào)控一氧化氮介導(dǎo)鼠CFs的MMPs/TIMPs表達(dá)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究[D];中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年
4 周欣;分離615小鼠ES細(xì)胞集落及誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2002年
5 宋曉平;小鼠胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2003年
6 章恩明;胚胎干細(xì)胞同步化處理、神經(jīng)分化及Aβ對(duì)分化神經(jīng)元NFκB通路的影響[D];浙江大學(xué);2005年
7 朱丹雁;淫羊藿苷誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞作用及其調(diào)控研究[D];浙江大學(xué);2005年
8 武明鑫;移植胚胎干細(xì)胞的衍生細(xì)胞治療全橫斷脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2006年
9 柯以銓;菲立磁標(biāo)記恒河猴骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞自體移植磁共振在體研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年
10 劉敬霞;腦脈通聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞再生的影響[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2007年
相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條
1 墨麗娟;尼古丁對(duì)干細(xì)胞心肌分化的影響研究[D];浙江大學(xué);2010年
2 鞏強(qiáng);microRNA在維甲酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用[D];華東師范大學(xué);2011年
3 謝丹丹;體外心肌樣微環(huán)境誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年
4 姚燕;組蛋白去乙�；�1調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌譜系轉(zhuǎn)分化[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2011年
5 武曉華;體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的研究[D];河北聯(lián)合大學(xué);2011年
6 王乃庚;腦外傷病人外周血CD34~+細(xì)胞及白細(xì)胞含量的動(dòng)態(tài)變化[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年
7 江和碧;bFGF對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用及機(jī)制[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2003年
8 章淑芳;小鼠ES細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化與建系實(shí)驗(yàn)研究[D];浙江大學(xué);2004年
9 陳良強(qiáng);胚胎干細(xì)胞分化神經(jīng)細(xì)胞特性及分化機(jī)制的研究[D];浙江大學(xué);2005年
10 任洪峰;不同訓(xùn)練方式對(duì)大鼠跟腱改建影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年
，
本文編號(hào)：
2405953
