【摘要】：第一部分HRCA技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變 目的：建立一種快速準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變的支鏈滾環(huán)擴(kuò)增（hyper-branched rolling circleamplification，HRCA）技術(shù)。 方法：1.通過查閱文獻(xiàn)并進(jìn)行臨床調(diào)查，確立結(jié)核分枝桿菌rpoB基因531位點(diǎn)絲氨酸突變（C-T）的檢測(cè)目標(biāo)。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的rpoB基因標(biāo)準(zhǔn)序列信息（從NCBI中獲得），設(shè)計(jì)檢測(cè)該基因突變位點(diǎn)的鎖式探針以及用于臨床標(biāo)本耐藥基因rpoB基因的PCR擴(kuò)增引物。2.建立并優(yōu)化檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變的支鏈滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，，包括：鎖式探針與模板連接環(huán)化溫度，連接環(huán)化時(shí)間；滾環(huán)擴(kuò)增最適溫度、擴(kuò)增時(shí)間。3.通過對(duì)人工合成的野生型靶序列、突變型靶序列、其他非相關(guān)基因序列以及不加靶序列的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，討論該方法的特異性和靈敏度。4.采用支鏈滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。 結(jié)果：1.鎖式探針與相應(yīng)模板65℃連接1h可保證檢測(cè)的特異性。37℃滾環(huán)擴(kuò)增1h，能夠得到明顯的擴(kuò)增結(jié)果，且通過對(duì)不同濃度突變型靶序列樣本的檢測(cè)，采用該技術(shù)最低能檢測(cè)出樣本中含有1%的突變株。2.利用支鏈滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)分別檢測(cè)了臨床結(jié)核桿菌利福平耐藥株、利福平敏感株以及結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv。檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。 結(jié)論：我們建立的用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變的支鏈滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性高、靈敏度高、簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)點(diǎn)。本檢測(cè)方法與傳統(tǒng)方法相比，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且不需特殊儀器和試劑，大大降低了檢測(cè)成本。 第二部分滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合DNA芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變 目的：將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)與DNA芯片技術(shù)相結(jié)合，建立一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變的芯片技術(shù)。 方法：1.以結(jié)核分枝桿菌rpoB基因?yàn)檠芯繉?duì)象，選擇531位點(diǎn)的絲氨酸突變（C-T）作為檢測(cè)目標(biāo)，根據(jù)鎖式探針與模板結(jié)合區(qū)外的序列設(shè)計(jì)通用寡核苷酸探針，作為捕獲探針，用于包被醛基玻片。2.通過檢測(cè)人工合成的野生型和突變型靶序列，證明所設(shè)計(jì)寡核苷酸探針的準(zhǔn)確性及本檢測(cè)方法的可靠性，并優(yōu)化該方法的反應(yīng)條件，同時(shí)討論其特異性和靈敏度。3.利用本方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與樣本測(cè)序結(jié)果比對(duì)，從而驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性及臨床應(yīng)用價(jià)值。 結(jié)果：1.將設(shè)計(jì)好的捕獲探針點(diǎn)于醛基片上預(yù)先設(shè)計(jì)好的點(diǎn)樣點(diǎn)，對(duì)人工合成靶序列進(jìn)行檢測(cè)。相應(yīng)突變型位點(diǎn)和陽性對(duì)照位點(diǎn)均有明顯顯影結(jié)果，背景清晰，陰性對(duì)照位點(diǎn)及其他點(diǎn)樣點(diǎn)均無顯影結(jié)果。證明設(shè)計(jì)的探針合理可靠，本檢測(cè)方法特異性好且準(zhǔn)確可靠。2.通過對(duì)不同濃度突變型靶序列樣本的檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)該方法最低可檢測(cè)出含有5fmol/L突變型靶序列的樣本。3.采用本方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽性對(duì)照與突變型點(diǎn)樣點(diǎn)均有明顯顯影結(jié)果，背景清晰；陰性對(duì)照、野生型、非該位點(diǎn)突變型及非結(jié)核序列點(diǎn)樣點(diǎn)均無顯影結(jié)果。該結(jié)果與臨床樣本測(cè)序結(jié)果一致，證明本檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠。 結(jié)論：本研究成功建立了RCA聯(lián)合DNA芯片技術(shù)，該技術(shù)可用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥的rpoB基因單堿基突變，具有特異性高、靈敏度高，不需要特殊儀器，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，并可用于臨床樣本的檢測(cè)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416

【參考文獻(xiàn)】

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1 賈雙榮;張可s

本文編號(hào)：2404479