【摘要】：第一部分HRCA技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變 目的：建立一種快速準確、經(jīng)濟簡便的檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變的支鏈滾環(huán)擴增（hyper-branched rolling circleamplification，HRCA）技術(shù)。 方法：1.通過查閱文獻并進行臨床調(diào)查，確立結(jié)核分枝桿菌rpoB基因531位點絲氨酸突變（C-T）的檢測目標。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Rv的rpoB基因標準序列信息（從NCBI中獲得），設計檢測該基因突變位點的鎖式探針以及用于臨床標本耐藥基因rpoB基因的PCR擴增引物。2.建立并優(yōu)化檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變的支鏈滾環(huán)擴增技術(shù)，，包括：鎖式探針與模板連接環(huán)化溫度，連接環(huán)化時間；滾環(huán)擴增最適溫度、擴增時間。3.通過對人工合成的野生型靶序列、突變型靶序列、其他非相關(guān)基因序列以及不加靶序列的反應體系進行檢測，討論該方法的特異性和靈敏度。4.采用支鏈滾環(huán)擴增技術(shù)對臨床標本進行檢測，驗證該檢測技術(shù)的臨床應用價值。 結(jié)果：1.鎖式探針與相應模板65℃連接1h可保證檢測的特異性。37℃滾環(huán)擴增1h，能夠得到明顯的擴增結(jié)果，且通過對不同濃度突變型靶序列樣本的檢測，采用該技術(shù)最低能檢測出樣本中含有1%的突變株。2.利用支鏈滾環(huán)擴增技術(shù)分別檢測了臨床結(jié)核桿菌利福平耐藥株、利福平敏感株以及結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv。檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致。 結(jié)論：我們建立的用于檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變的支鏈滾環(huán)擴增技術(shù)，具有特異性高、靈敏度高、簡單易操作的優(yōu)點。本檢測方法與傳統(tǒng)方法相比，大大縮短了檢測時間，而且不需特殊儀器和試劑，大大降低了檢測成本。 第二部分滾環(huán)擴增技術(shù)聯(lián)合DNA芯片檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變 目的：將滾環(huán)擴增技術(shù)與DNA芯片技術(shù)相結(jié)合，建立一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變的芯片技術(shù)。 方法：1.以結(jié)核分枝桿菌rpoB基因為研究對象，選擇531位點的絲氨酸突變（C-T）作為檢測目標，根據(jù)鎖式探針與模板結(jié)合區(qū)外的序列設計通用寡核苷酸探針，作為捕獲探針，用于包被醛基玻片。2.通過檢測人工合成的野生型和突變型靶序列，證明所設計寡核苷酸探針的準確性及本檢測方法的可靠性，并優(yōu)化該方法的反應條件，同時討論其特異性和靈敏度。3.利用本方法對臨床樣本進行檢測，并將檢測結(jié)果與樣本測序結(jié)果比對，從而驗證本方法的準確性及臨床應用價值。 結(jié)果：1.將設計好的捕獲探針點于醛基片上預先設計好的點樣點，對人工合成靶序列進行檢測。相應突變型位點和陽性對照位點均有明顯顯影結(jié)果，背景清晰，陰性對照位點及其他點樣點均無顯影結(jié)果。證明設計的探針合理可靠，本檢測方法特異性好且準確可靠。2.通過對不同濃度突變型靶序列樣本的檢測，研究發(fā)現(xiàn)該方法最低可檢測出含有5fmol/L突變型靶序列的樣本。3.采用本方法對臨床樣本進行檢測，結(jié)果顯示，陽性對照與突變型點樣點均有明顯顯影結(jié)果，背景清晰；陰性對照、野生型、非該位點突變型及非結(jié)核序列點樣點均無顯影結(jié)果。該結(jié)果與臨床樣本測序結(jié)果一致，證明本檢測方法準確可靠。 結(jié)論：本研究成功建立了RCA聯(lián)合DNA芯片技術(shù)，該技術(shù)可用于檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥的rpoB基因單堿基突變，具有特異性高、靈敏度高，不需要特殊儀器，操作簡單的特點，并可用于臨床樣本的檢測。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416

【參考文獻】

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1 賈雙榮;張可s

本文編號：2404479