【摘要】： UL16結(jié)合蛋白(UL16 Binding Proteins，ULBPs)是一個NK細(xì)胞活化型受體一NKG2D的配體家族，目前發(fā)現(xiàn)的同系物包括ULBP1～5。ULBPs可應(yīng)激性表達(dá)在一些腫瘤細(xì)胞或病原體感染細(xì)胞的表面。ULBP1、2、和3之間存在55-60%同源性，而ULBP4序列則變化較大，且相關(guān)研究較少，僅限于ULBP4-NKG2D相互作用和活化NK細(xì)胞方面。 γδT細(xì)胞表面表達(dá)NKG2D，可識別MICA、ULBPs分子等配體分子。研究發(fā)現(xiàn)，γδT細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(TCR)γ和δ鏈異質(zhì)二聚體分子也識別MICA。這種NKG2D和TCRγδ對相同配體分子雙重識別的生物學(xué)意義尚不完全明了，據(jù)推測，可能與確保固有免疫細(xì)胞能及時清除表達(dá)應(yīng)激分子的受損細(xì)胞有關(guān)的免疫監(jiān)視功能有關(guān)。 本研究關(guān)注以下四個科學(xué)問題： 第一，回答TCRγδ是否識別ULBP4分子?這一問題至今尚無答案。事實上，ULBPs家族分子是否可與TCRγδ結(jié)合，至今無結(jié)構(gòu)生物學(xué)的證據(jù)。由于ULBP4具有一定的基因表達(dá)的多樣性，，我們推測機(jī)體可能會啟動具有受體多樣性的TCRγδ對其產(chǎn)生識別，故以ULBP4分子為靶分子，探討TCRγδ對其識別的可能性。在這一問題框架下，我們要研究δ1鏈，或δ2鏈對其結(jié)合的特異性，并探究δ鏈中與配體結(jié)合起關(guān)鍵作用的部位一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)3的基因序列變化的特點。 第二，澄清ULBP4反應(yīng)性γδT細(xì)胞的特性，如主要亞群，細(xì)胞因子分泌譜系和腫瘤細(xì)胞毒等。 第三，利用抗體阻斷實驗分析ULBP4-NKG2D和ULBP4-TCRγδ雙重識別的生物學(xué)意義。 第四，通過ULBP4在EB病毒感染B淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)和ULBP4介導(dǎo)的γδT細(xì)胞細(xì)胞毒分析，來探究ULBP4在免疫監(jiān)視(尤其是在細(xì)胞惡變早期)中的作用。 我們希望通過針對以上四個科學(xué)問題的科學(xué)研究可基本闡明γδ-T細(xì)胞對ULBP4識別的機(jī)制，并為系統(tǒng)闡釋ULBP4的生物學(xué)意義提供有價值的資料。 為解決上述科學(xué)問題，我們進(jìn)行了以下研究：(1)利用293ET真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了人ULBP4分子胞外區(qū)(1～226氨基酸)的重組蛋白ULBP4_(1-226)；利用pcDNA真核表達(dá)載體系統(tǒng)在EL4細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)全長的ULBP4基因，這些系統(tǒng)的建立為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。(3)首次使用固相化ULBP4分子誘導(dǎo)OEC和CC中的腫瘤浸潤γδT淋巴細(xì)胞的體外擴(kuò)增，獲得純度為80%的Vδ2 T細(xì)胞，并開展ULBP4反應(yīng)性γδT細(xì)胞TCR Vδ-CDR3區(qū)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。(4)利用配體受體酶聯(lián)免疫結(jié)合實驗、流式細(xì)胞術(shù)和γδTCR基因轉(zhuǎn)染的TCR-β鏈缺陷型的T細(xì)胞系J．RT3-T3．5細(xì)胞平臺證實，ULBP4與TCRγ9δ2特異結(jié)合。(5)ELISA法檢測ULBP4刺激γδT細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的譜系。MTT方法檢測γδT細(xì)胞對表達(dá)ULBP4的腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。(6)在抗體封閉實驗中，分別分析了anti-NKG2D、anti-TCRγδ、anti-NKG2D+anti-TCRγδ單抗封閉前后，ULBP4活化的γδT細(xì)胞分泌IFN-γ水平及對ULBP4陽性的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒的變化。實驗結(jié)果顯示，anti-NKG2D+anti-γδTCR單抗聯(lián)合阻斷的效果強(qiáng)于anti-γδTCR或anti-NKG2D單獨阻斷作用。(7)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和組織化學(xué)方法，檢測ULBP4在不同來源腫瘤細(xì)胞、組織和EB病毒轉(zhuǎn)化前后B淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)。分析ULBP4介導(dǎo)的γδT細(xì)胞細(xì)胞毒效應(yīng)。 綜上，γδT細(xì)胞可憑借表面的NKG2D和TCRγδ結(jié)合并識別與腫瘤和感染相關(guān)的應(yīng)激分子ULBP4，其自身發(fā)生細(xì)胞活化，對腫瘤細(xì)胞，惡變細(xì)胞，病毒感染細(xì)胞迅速產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，體現(xiàn)了固有免疫系統(tǒng)在免疫監(jiān)視中所發(fā)揮的直接與迅捷的特點。以ULBP4為靶的免疫診斷與治療策略可能為腫瘤的早期診斷與干預(yù)提供新型手段。
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【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 許艷,萬敏,張培因,衛(wèi)紅飛,王麗穎;六聚組氨酸在重組蛋白中的位置對鎳親和層析的影響[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2004年02期

2 李伯良，胡明，楊新穎，周彬，梁鎮(zhèn)和，李其梁，湯錦炎;人胰島素生長因子Ⅰ基因的人工合成、克隆及其表達(dá)[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報;1994年02期

本文編號：2403274