【摘要】： 目的:鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性近年呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì),給臨床治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。主動(dòng)外排泵與細(xì)菌耐藥密切相關(guān)。本試驗(yàn)采用分子生物學(xué)方法研究鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株的多重耐藥表型、泵抑制劑的干預(yù)作用及主動(dòng)外排系統(tǒng):RND型外排泵AdeABC、AdeIJK和MATE型外排泵AbeM的泵基因攜帶、表達(dá)及外排泵AdeABC的調(diào)控系統(tǒng)AdeRS的基因序列變化情況,為指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物、減少細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)或傳播、新型抗菌藥物的研制提供依據(jù)。 方法: 1、菌株收集、藥敏試驗(yàn)與泵抑制劑干預(yù)試驗(yàn):收集自2006年1月至2008年6月期間天津市3家三級(jí)甲等醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌共35株,其中多重耐藥株30株,敏感株5株。采用微量肉湯稀釋法和瓊脂紙片擴(kuò)散法測(cè)定臨床菌株對(duì)13種常用抗菌藥物(哌拉西林、頭孢氨噻肟、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星)的MIC值,分析耐藥率。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定未加用和加用泵抑制劑CCCP時(shí)菌株對(duì)8種抗菌藥物(左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素、阿米卡星、頭孢他定、頭孢哌酮/舒巴坦)的MIC值,分析泵抑制劑對(duì)菌株耐藥表型的影響。 2、RND型外排泵AdeABC、AdeIJK和MATE型外排泵AbeM的泵基因檢測(cè)及mRNA的表達(dá):應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增全部實(shí)驗(yàn)菌株的adeB、adeJ和abeM基因,選擇10株多重耐藥株和5株敏感株進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),以內(nèi)參基因recA為對(duì)照,進(jìn)行凝膠掃描半定量分析。 3、RND型外排泵AdeABC的調(diào)控系統(tǒng)AdeRS的編碼基因檢測(cè)及序列分析:應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增adeR和adeS基因,選擇2株多重耐藥株和2株敏感株的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,并與GenBank公布的序列進(jìn)行比對(duì)分析。 結(jié)果: 1、藥敏試驗(yàn)結(jié)果和泵抑制劑對(duì)耐藥表型的影響:30株多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株對(duì)抗菌藥物的耐藥率為:環(huán)丙沙星(100%),氧氟沙星(100%),哌拉西林(100%),頭孢噻肟(100%),頭孢他定(100%),頭孢哌酮(100%),頭孢曲松(100%),頭孢吡肟(100%),慶大霉素(100%),阿米卡星(100%),左氧氟沙星(50%),頭孢哌酮/舒巴坦(26.67%),亞胺培南(10%)。30株多重耐藥株在使用CCCP后均出現(xiàn)了對(duì)一種或一種以上抗菌藥物的MIC值較前下降4倍或4倍以上。5株敏感株在應(yīng)用CCCP后,其中2株對(duì)氧氟沙星的MIC值較前下降2倍,1株對(duì)頭孢他定的MIC值較前下降2倍,2株對(duì)慶大霉素的MIC值較前下降2-4倍。 2、外排泵基因檢測(cè)及mRNA的表達(dá)情況:30株多重耐藥株和5株敏感株均攜帶泵基因adeB、adeJ和aheM,10株多重耐藥株的adeB相對(duì)表達(dá)水平(灰度)為(1.211-9.169),而adeB基因在5株敏感株中均未檢測(cè)到mRNA表達(dá);10株多重耐藥臨床株的adeJ相對(duì)表達(dá)水平(灰度)為(0.956-4.519),平均1.75;5株敏感株為(0.356-0.576),平均0.426;abeM基因在10株多重耐藥株和5株敏感株中均未檢測(cè)到mRNA表達(dá)。 3、調(diào)控基因adeRS的檢測(cè)及序列比對(duì):檢測(cè)2株敏感株AbS2與AbS5的adeR序列相同,與GenBank中公布的AY426969比對(duì),同源性為97%。耐藥株AbM1與AbM4的adeR基因序列相同,與AY426969比對(duì)同源性為97%。AbM1、AbM4與AbS2、AbS5 adeR基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)出現(xiàn):Ile14→Val、Val120→Ile、Ala136→Val。AbS2與AbS5的adeS序列相同,與AY426969比對(duì)同源性為97%。AbM1與AbM4的adeS基因序列相同,與AY426969比對(duì)同源性為96%。AbM1、AbM4與AbS2、AbS5 adeS基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)出現(xiàn):Gly186→Val、Asn213→Asp、Ile285→Leu、Asn268→His、Val331→Ile、Val348→Ile、Gly356→Asn、His357→Asn,357位后氨基酸缺失。 結(jié)論: 1、泵抑制劑CCCP的應(yīng)用,可使鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥株對(duì)一種或多種抗菌藥物MIC值較前降低,這表明外排泵功能對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥有一定貢獻(xiàn)。 2、RND型外排泵基因adeB和adeJ在10株多重耐藥株和5株敏感株中的表達(dá)差異,可能與鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥有關(guān)。MATE型外排泵基因abeM在多重耐藥株和敏感株中均未檢測(cè)到mRNA的表達(dá),有待擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)例數(shù)進(jìn)一步研究。 3、2株多重耐藥株和2株敏感株的調(diào)控基因adeRS基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì),出現(xiàn)氨基酸替代和缺失,可能與外排泵AdeABC表達(dá)差異有關(guān),基因變異與蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。敏感株AbS5的adeRS基因序列已提交GenBank,登錄號(hào)為FJ495118、FJ600366。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R378.99

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號(hào)：2394071