發(fā)布時(shí)間：2018-12-20 22:18

【摘要】： 隨著人們生活水平的不斷提高,Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率不斷提高,研究表明血漿中脂聯(lián)素(ADPN)的含量與這類(lèi)疾病的發(fā)生成負(fù)相關(guān),因此檢測(cè)人血漿中脂聯(lián)素的含量可預(yù)知這類(lèi)疾病的發(fā)生的可能性,可以盡早的為病人提供信息。目前檢測(cè)人血清中的脂聯(lián)素含量主要通過(guò)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè),市面上的檢測(cè)試劑盒均為進(jìn)口,國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。 根據(jù)NCBI上公布的序列NM_004797.2,利用primer5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物。提取人脂肪組織總RNA,通過(guò)RT-PCR獲得732bp的人脂聯(lián)素全基因目的基因片段。將目的片段克隆入載體pET-CKS并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli TOP10F',進(jìn)行PCR鑒定,堿裂解法提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定,鑒定為陽(yáng)性的菌株進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與NCBI上的序列進(jìn)行比對(duì),閱讀框正確的重組質(zhì)粒命名為pET-CKS/ADPN。 重組質(zhì)粒pET-CKS/ADPN轉(zhuǎn)入表達(dá)菌E.coli BL21-gold中,在化學(xué)劑-異丙基硫代-β-D-半乳酸糖苷(IPTG)的作用自下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳表明重組蛋白以包涵體的形式出現(xiàn),Western blot檢測(cè)融合蛋白與兔抗人脂聯(lián)素抗體反應(yīng),證明其具有免疫反應(yīng)性。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化,確立了最佳的誘導(dǎo)條件為：30℃,0.1mM IPTG濃度,誘導(dǎo)表達(dá)8h。因融合蛋白氨基端含有6個(gè)組氨酸(His-tag),可以用鎳金屬親和層析純化目的蛋白,將純化得到的融合蛋白溶液進(jìn)行透析復(fù)性,檢測(cè)其濃度較高,可進(jìn)行動(dòng)物免疫。 將復(fù)性的重組蛋白免疫家兔,間接ELISA檢測(cè)兔抗血清效價(jià),在第六次免疫后,效價(jià)達(dá)到5×104左右,雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兔抗血清效價(jià),當(dāng)其效價(jià)達(dá)到1：64后,殺兔取血,硫酸銨沉淀法和陰離子交換層析法純化兔抗人脂聯(lián)素多克隆抗體,測(cè)定其濃度為2.3mg/mL。 將抗人脂聯(lián)素單克隆抗體作為固相抗體,采用改良的碘酸鈉法,對(duì)人脂聯(lián)素多克隆抗體進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記,作為標(biāo)記抗體,初步建立人脂聯(lián)素雙抗體夾心ELISA檢測(cè)模式。棋盤(pán)滴定法確立人脂聯(lián)素單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1：1000,酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1：1500。以重組脂聯(lián)素蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),線(xiàn)性范圍為2ng-10ng。臨床測(cè)定111份Ⅱ型糖尿病人血清脂聯(lián)素濃度為6.5±0.33ng/mL,89份非Ⅱ型糖尿病人血清脂聯(lián)素濃度為9.9±1.08ng/mLo 本文通過(guò)基因工程方法得到了有免疫活性的重組人脂聯(lián)素蛋白,制備了兔抗人脂聯(lián)素多克隆抗體,初步建立的人脂聯(lián)素雙抗體夾心檢測(cè)模型,為進(jìn)一步研究脂聯(lián)素的生化性質(zhì)及生理功能和人脂聯(lián)素ELISA檢測(cè)試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:With the improvement of people's living standard, the incidence of type 鈪，

本文編號(hào)：2388500