【摘要】：p38調(diào)節(jié)活化蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase, PRAK)最初是作為p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAP kinase/p38 MAPK)的下游激酶被鑒定出來(lái)的,屬絲裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶(MAPK-activated protein kinase, MAPKAP kinase/MK)家族成員；PRAK存在于大多數(shù)脊椎動(dòng)物細(xì)胞中,而線蟲(chóng)、果蠅等低等生物不存在編碼PRAK的基因；PRAK分子量約54 kD,人的PRAK編碼基因編碼兩種不同剪接體,分別由471和473個(gè)氨基酸組成,后者與前者相比,在C-末端多2個(gè)氨基酸殘基；不同剪接體序列的差異有何功能意義目前仍未清楚。PRAK廣泛存在于人的多種組織和細(xì)胞系中,尤以心肌及骨骼肌表達(dá)水平最高。在靜息狀態(tài)下,外源性PRAK主要分布于細(xì)胞核內(nèi),在細(xì)胞應(yīng)激時(shí),PRAK可發(fā)生核-質(zhì)移位(nuclear-cytoplasmic translocation);而內(nèi)源性PRAK的細(xì)胞定位則存在爭(zhēng)議,不同研究報(bào)道的結(jié)果不一致。PRAK是MK家族中較新的一個(gè)成員,相關(guān)研究報(bào)道不多；其激活機(jī)制、下游底物、介導(dǎo)的功能等,至今仍未完全清楚。 早期的研究顯示PRAK可受p38 MAPK通路調(diào)控,參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)；細(xì)胞在應(yīng)激和致炎因子的刺激下,PRAK的第182位蘇氨酸(Thr182)能夠被p38MAPK磷酸化而激活,并繼而磷酸化并激活熱休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27),從而介導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu),參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)；而且,p38 MAPK引起的PRAK磷酸化可導(dǎo)致PRAK的核-質(zhì)移位,但PRAK的移位與其介導(dǎo)的功能有何關(guān)系至今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。上述關(guān)于PRAK參與p38 MAPK介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的觀點(diǎn)近年受到質(zhì)疑；有研究表明,雖然過(guò)表達(dá)的p38 MAPK確能磷酸化PRAK,但生理表達(dá)水平的內(nèi)源性p38 MAPK并不能顯著增加PRAK活性,而且內(nèi)源性PRAK也不能有效地激活HSP27；蛋白質(zhì)相互作用分析也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性PRAK- p38 MAPK蛋白質(zhì)復(fù)合體形成的證據(jù)。因此,PRAK與p38MAPK通路的關(guān)系,以及PRAK的底物可能都需要重新評(píng)價(jià)。有研究者認(rèn)為PRAK可能參與癌基因ras的表達(dá)產(chǎn)物所誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老過(guò)程,此過(guò)程也可能涉及p38MAPK通路；即Ras通過(guò)某種方式激活p38 MAPK通路,后者引起PRAK的磷酸化、激活,激活的PRAK再磷酸化、激活p53,從而促進(jìn)細(xì)胞衰老,并抑制細(xì)胞惡變。 另一PRAK調(diào)控因素是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulated protein kinase, ERK)成員ERK3和ERK4；研究顯示,PRAK能與ERK3/ERK4形成復(fù)合體,并磷酸化和激活PRAK,同時(shí)引起PRAK核-質(zhì)移位；PRAK基因敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育缺陷和死亡,而胚胎死亡發(fā)生的時(shí)間剛好與ERK3的mRNA在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)高峰時(shí)間相一致；因而推測(cè)PRAK可能參與ERK3/ERK4介導(dǎo)的胚胎發(fā)育的調(diào)控過(guò)程,但PRAK通過(guò)何種底物發(fā)揮此作用尚不清楚。 綜上所述,PRAK可能參與多種細(xì)胞功能的調(diào)控過(guò)程,但目前對(duì)PRAK的功能及其作用機(jī)制認(rèn)識(shí)還極為有限,并且在一些問(wèn)題上還存在著爭(zhēng)議；此外,PRAK是否還有其它未發(fā)現(xiàn)的激活調(diào)控途徑以及其它功能?這些問(wèn)題都需要作進(jìn)一步研究探討。 細(xì)胞中蛋白質(zhì)往往以多蛋白復(fù)合體的方式發(fā)揮作用。在許多情況下,功能蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位和激活后移位以及伴隨的與其它蛋白質(zhì)的可逆性結(jié)合是行使其功能的關(guān)鍵所在。因此,研究PRAK與其它蛋白質(zhì)的相互作用,將有助于揭示其生物學(xué)功能及其行使功能的分子機(jī)制。串聯(lián)親和純化(tandem affinity purification, TAP)耦聯(lián)質(zhì)譜(mass spectrometry, MS)分析技術(shù)是近年出現(xiàn)的一利,純化、鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合體組分的新策略。TAP技術(shù)的核心是：應(yīng)用分子克隆方法將所研究的蛋白質(zhì)復(fù)合體中一已知蛋白質(zhì)組分：誘餌蛋白(bait)與兩個(gè)不同的親和標(biāo)簽(tag)融合,利用標(biāo)簽與偶聯(lián)于固相介質(zhì)的配體之間的親和結(jié)合活性,經(jīng)過(guò)連續(xù)兩步的親和純化,在生理?xiàng)l件下將誘餌蛋白及其相互作用的蛋白質(zhì)以蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式純化出來(lái)。TAP技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)在于能獲得生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)真實(shí)的蛋白質(zhì)相互作用信息,TAP的應(yīng)用使蛋白質(zhì)相互作用的研究在方法學(xué)上獲得很大的進(jìn)步。 為了獲得更多有關(guān)PRAK的功能線索,我們引入了Stratagene公司新開(kāi)發(fā)的適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的TAP系統(tǒng)(InterPlay Mammalian TAP System)進(jìn)行PRAK相互作用蛋白質(zhì)的鑒定。該系統(tǒng)使用鏈親和素結(jié)合多肽(streptavidin binding peptide, SBP)和鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(calmodulin binding peptide, CBP)作為T(mén)AP標(biāo)簽；與經(jīng)典的TAP標(biāo)簽相比,該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于：分離的流程不但變得更加簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì),而且不需使用蛋白酶酶切,避免了因酶污染對(duì)后續(xù)質(zhì)譜分析的影響；此外,SBP標(biāo)簽較小,可有效減少因大分子TAP標(biāo)簽對(duì)誘餌蛋白正確折疊的影響而引起的活性變化。 在本研究中我們首先將PRAK編碼序列克隆到TAP表達(dá)載體上,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pNTAP-PRAK;然后,通過(guò)Western blot和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察了融合蛋白在細(xì)胞的表達(dá)和定位情況,檢測(cè)結(jié)果表明融合蛋白能有效表達(dá),TAP標(biāo)簽沒(méi)有明顯影響PRAK的細(xì)胞定位,融合蛋白也未影響TAP標(biāo)簽中的CBP抗原性。 為避免因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染引起融合蛋白的過(guò)高表達(dá)及其導(dǎo)致的非天然、非特異的蛋白質(zhì)相互作用而造成假陽(yáng)性鑒定結(jié)果,我們通過(guò)G418篩選,建立起穩(wěn)定、低水平表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞系HEK293-TAP-PRAK。此外,為排除TAP標(biāo)簽非特異性結(jié)合而引起的假陽(yáng)性結(jié)果,我們還建立起穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的HEK293-TAP細(xì)胞系作為T(mén)AP的陰性對(duì)照系統(tǒng)。 隨后,利用TAP陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒觀察了TAP系統(tǒng)純化的效果,預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們的TAP純化效果是較為滿意的。 最后,我們利用TAP系統(tǒng)結(jié)合熒光差異雙向凝膠電泳(difference gel electro-phoresis, DIGE)和質(zhì)譜鑒定了NaAsO2刺激與非刺激條件下PRAK的差異相互作用蛋白質(zhì)。DIGE結(jié)果分析共獲得14個(gè)差異大于1.8倍的PRAK相互作用蛋白質(zhì)差異點(diǎn)(增多的11個(gè),減少的3個(gè)),14個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析共鑒定出12個(gè)候選差異蛋白質(zhì)。鑒定出的差異蛋白質(zhì)包括：參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白質(zhì)、蛋白激酶、參與發(fā)育調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)、參與actin/細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)和MAPK信號(hào)通路相關(guān)的蛋白質(zhì)等。 總之,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TAP系統(tǒng)純化分離出HEK293-TAP-PRAK細(xì)胞在NaAsO2刺激與非刺激下的PRAK蛋白復(fù)合體,純化產(chǎn)物經(jīng)DIGE分離,找出差異蛋白點(diǎn),并對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析。通過(guò)本研究,我們得出以下幾點(diǎn)結(jié)論： 1.成功把PRAK編碼序列克隆到TAP真核表達(dá)載體上 2.建立起穩(wěn)定表達(dá)tags (TAP)-PRAK融合蛋白的細(xì)胞系(HEK293-TAP-PRAK),穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的鑒定結(jié)果表明穩(wěn)定表達(dá)能有效降低外源蛋白的過(guò)高表達(dá),融合標(biāo)簽未對(duì)PRAK的表達(dá)及其定位產(chǎn)生明顯影響,融合蛋白也未影響TAP標(biāo)簽中的CBP抗原性。 3.成功引進(jìn)了TAP系統(tǒng),并建立起作為T(mén)AP陰性對(duì)照的HEK293-TAP穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。 4.利用TAP系統(tǒng)純化出NaAsO2刺激與非刺激條件下的PRAK蛋白復(fù)合體,經(jīng)DIGE分析,獲得14個(gè)蛋白質(zhì)差異點(diǎn),質(zhì)譜鑒定出12個(gè)候選差異蛋白質(zhì)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2381454