【摘要】： 經(jīng)典的抗原遞呈理論認(rèn)為,抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)在加工處理和遞呈外源性抗原及內(nèi)源性抗原時(shí)存在兩種不同的途徑,即分別為MHCⅡ類分子限制性途徑和MHCⅠ類分子限制性途徑。然而研究發(fā)現(xiàn),外源性抗原經(jīng)APC攝取、加工處理后,可與MHCⅠ類分子結(jié)合形成復(fù)合物,呈遞到APC表面,進(jìn)而活化CD8+T細(xì)胞,這種現(xiàn)象被稱為交叉遞呈。大量研究表明,顆粒性抗原、可溶性抗原等多種抗原都可以經(jīng)過交叉遞呈途徑有效活化CTL應(yīng)答。交叉遞呈在機(jī)體抵抗感染非APC的病毒和其它病原微生物、誘導(dǎo)抗腫瘤免疫及維持外周耐受等方面都發(fā)揮著重要作用。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)是體內(nèi)最有效的專職APC,也是執(zhí)行交叉遞呈功能的主要細(xì)胞。 DC需要經(jīng)歷由不成熟向成熟階段的轉(zhuǎn)變才能有效刺激T細(xì)胞活化。DC成熟過程中抗原攝取能力下降,同時(shí)伴隨細(xì)胞表型及細(xì)胞形態(tài)的改變。所有這些變化均與受Rho GTPases家族調(diào)控的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排關(guān)系密切。Rho家族由至少23個(gè)成員組成,其中以RhoA,Rac1和Cdc42研究最為廣泛。近年來研究發(fā)現(xiàn),Rho家族蛋白在DC的形態(tài)、內(nèi)吞作用、遷移以及MHCⅡ類分子限制性遞呈和交叉遞呈中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。DC成熟過程中內(nèi)吞能力的下降與Cdc42活化水平的下調(diào)密切相關(guān);活化型Cdc42和RhoA可增強(qiáng)DC的MHCⅡ類分子限制性遞呈;抑制Rac1可以減少DC對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬及交叉遞呈。 Rho家族成員雖然功能各不相同,但卻具有高度的同源性,各成員間最主要的差別在于其高變的C-末端多堿基區(qū),且研究認(rèn)為C-末端多堿基區(qū)在Rho GTPases生理功能的發(fā)揮中起著關(guān)鍵性作用。Rac1通過其C-末端多堿基區(qū)不僅可以結(jié)合并活化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK,而且還可活化中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶。此外,Rac2的C-末端多堿基區(qū)也是Rac2在細(xì)胞內(nèi)的定位及細(xì)胞增殖、遷移等多種功能的發(fā)揮所必需的。以往研究利用Tat穿膜肽能夠快速、高效的將Rho家族成員C-末端多堿基區(qū)帶入細(xì)胞,并與下游信號(hào)通路中某些特定效應(yīng)蛋白直接結(jié)合的特性,研究C-末端多堿基區(qū)在Rho家族蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞功能中的作用�；诖�,我們希望利用Tat穿膜肽與Rho家族不同成員C-末端多堿基區(qū)構(gòu)成的融合肽,通過觀察其對(duì)DC交叉遞呈的影響來研究Rho家族不同成員C-末端多堿基區(qū)在DC交叉遞呈中的作用。 首先,本研究設(shè)計(jì)合成了6條由Tat穿膜肽和Rho家族不同成員C-末端多堿基區(qū)構(gòu)成的融合肽,包括Tat-Rac1、Tat-hRac2、Tat-mRac2、Tat-Rac3、Tat-RhoA和Tat-Cdc42 C-末端融合肽,以及Tat對(duì)照肽,進(jìn)而以表達(dá)dsRed-OVA144-386融合蛋白的大腸桿菌(E.coli BL21/pYOVA)為抗原,在成功建立DC2.4細(xì)胞抗原交叉遞呈分析平臺(tái)的基礎(chǔ)上,分析了不同融合肽對(duì)樹突狀細(xì)胞系DC2.4交叉遞呈的影響。本研究首次發(fā)現(xiàn)Tat-Rac1 C-末端肽能夠顯著增強(qiáng)DC2.4細(xì)胞的交叉遞呈。 其次,為了進(jìn)一步證實(shí)Tat-Rac1 C-末端肽促進(jìn)DC交叉遞呈結(jié)果的可靠性,本研究首先成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDC),并從細(xì)胞的形態(tài)、得率、純度以及LPS刺激前后細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況等幾方面對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,培養(yǎng)第7天的細(xì)胞具有典型的DC形態(tài)特征,純度可達(dá)80%~90%左右,且主要為不成熟DC。隨后以E.coli BL21/pYOVA為抗原,在建立BMDC抗原交叉遞呈分析平臺(tái)的基礎(chǔ)上,分析了Tat-Rac1 C-末端肽對(duì)BMDC交叉遞呈的影響。結(jié)果證實(shí),Tat-Rac1 C-末端肽明顯促進(jìn)BMDC的交叉遞呈,與DC2.4細(xì)胞的結(jié)果一致。 最后,本研究利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)從DC的吞噬及成熟兩方面對(duì)Tat-Rac1 C-末端肽促進(jìn)DC交叉遞呈的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。首先以E.coli BL21/pYOVA為抗原觀察Tat-Rac1 C-末端肽負(fù)載DC吞噬能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tat-Rac1 C-末端肽顯著增強(qiáng)DC對(duì)細(xì)菌抗原的吞噬,提示Tat-Rac1 C-末端肽對(duì)DC抗原交叉遞呈的促進(jìn)作用部分是由于增強(qiáng)DC的抗原攝取能力所致。進(jìn)而,本研究進(jìn)一步分析了Tat-Rac1 C-末端肽增強(qiáng)DC抗原攝取能力的可能機(jī)制。以FITC標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白、OVA、IgG抗體調(diào)理的大腸桿菌及葡聚糖四種熒光標(biāo)記物為抗原,觀察Tat-Rac1 C-末端肽負(fù)載DC抗原攝取能力的改變。結(jié)果表明,Tat-Rac1 C-末端肽并不影響DC對(duì)上述四種抗原的攝取,提示Tat-Rac1 C-末端肽增強(qiáng)DC的抗原攝取能力并不依賴于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、Fc段受體介導(dǎo)的吞噬以及巨吞飲這四條途徑。隨后,以表達(dá)OVA1-386蛋白的大腸桿菌為抗原,通過檢測(cè)Tat-Rac1 C-末端肽負(fù)載DC表面分子的表達(dá)水平分析其對(duì)DC成熟的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tat-Rac1 C-末端肽不影響DC的成熟,提示該融合肽并不是通過促進(jìn)DC的成熟而增強(qiáng)DC交叉遞呈。 綜上所述,本研究通過觀察Tat穿膜肽和Rho家族不同成員C-末端多堿基區(qū)構(gòu)成的融合肽對(duì)樹突狀細(xì)胞系DC2.4交叉遞呈的影響,首次發(fā)現(xiàn)Tat-Rac1 C-末端肽能夠顯著增強(qiáng)DC的交叉遞呈,并在小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞中得到證實(shí)。進(jìn)一步分析Tat-Rac1 C-末端肽促進(jìn)DC交叉遞呈的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)Tat-Rac1 C-末端肽明顯增強(qiáng)DC對(duì)細(xì)菌抗原的吞噬,說明Tat-Rac1 C-末端肽對(duì)DC抗原交叉遞呈的促進(jìn)作用部分是由于增強(qiáng)DC的抗原攝取能力所致,而與DC的成熟無關(guān)。DC抗原攝取能力的促進(jìn)作用可能是通過補(bǔ)體受體介導(dǎo)的吞噬或網(wǎng)格蛋白非依賴的內(nèi)吞途徑來實(shí)現(xiàn)的,而并不依賴于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、Fc段受體介導(dǎo)的吞噬以及巨吞飲這四條途徑。本研究為進(jìn)一步理解DC交叉遞呈的分子機(jī)制提供新的理論依據(jù),同時(shí),將Tat-Rac1 C-末端肽用于DC疫苗的抗腫瘤治療將對(duì)腫瘤免疫治療的研究產(chǎn)生重要影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄧勇軍;夏建川;周軍;王其京;張蓬原;張?zhí)m軍;戎鐵華;;樹突細(xì)胞-食管癌融合細(xì)胞體外誘導(dǎo)特異性抗食管癌免疫反應(yīng)[J];癌癥;2007年02期

2 劉婷;華川;;樹突狀細(xì)胞抗腫瘤免疫的研究進(jìn)展[J];重慶醫(yī)學(xué);2009年16期

3 孫正;許哲;祁曉平;黎介壽;;樹突細(xì)胞對(duì)免疫調(diào)節(jié)功能的影響[J];腸外與腸內(nèi)營養(yǎng);2006年01期

4 戴學(xué)軍;王偉民;;腫瘤免疫基因治療策略的臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)[J];廣東醫(yī)學(xué);2010年07期

5 ;GPC3 fused to an alpha epitope of HBsAg acts as an immune target against hepatocellular carcinoma associated with hepatitis B virus[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2011年02期

6 柯奇周;王婭蘭;;樹突狀細(xì)胞在腫瘤中的研究進(jìn)展[J];國際腫瘤學(xué)雜志;2006年03期

7 吳塵軒;杜智;;樹突狀細(xì)胞與肝細(xì)胞癌免疫治療[J];國際腫瘤學(xué)雜志;2006年05期

8 ;Clinical Significance of Serum IL-18 and IL-18BP in Patients with Benign or Malignant Primary Liver Tumors[J];Clinical Oncology and Cancer Research;2009年04期

9 陳威巍;施明;石峰;辛紹杰;王福生;;HBV表面抗原和核心抗原聯(lián)合負(fù)載的HBV相關(guān)性肝癌患者樹突狀細(xì)胞功能研究(英文)[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

10 孫正;許哲;祁小平;李剛;吳曉宇;陳徹;黎介壽;;樹突狀細(xì)胞-結(jié)直腸癌細(xì)胞融合疫苗的制備及生物學(xué)特性的研究[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2006年01期

，

本文編號(hào)：2373783