【摘要】：研究目的(1)探討臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可否成功的在體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增并誘導(dǎo)成心肌樣細(xì)胞；探討臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定,經(jīng)體外擴(kuò)增、純化的方法以及定向分化成心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)劑5-氮胞苷(5-AZA)作用后的生物學(xué)特性；(2)觀察臍血間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌細(xì)胞在體外共同培養(yǎng),與臍血MSCs共同培養(yǎng)的心肌細(xì)胞是否具有抵抗缺氧引起的凋亡;(3)觀察體外進(jìn)行長期的培養(yǎng)和擴(kuò)增臍血MSCs,以及對細(xì)胞的遺傳物質(zhì)有修飾作用的試劑5-AZA進(jìn)行體外誘導(dǎo)后的臍血MSCs的生物安全性；(4)進(jìn)行重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對進(jìn)行骨髓動員,然后分離純化其外周血單個核細(xì)胞,將單核細(xì)胞經(jīng)心導(dǎo)管在梗死相關(guān)動脈內(nèi)注射治療的急性心肌梗死患者進(jìn)行臨床指標(biāo)的觀察。 方法與結(jié)果 第一部分：提取健康妊娠產(chǎn)婦分娩的胎兒臍帶血,分離單個核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,取第3代以后細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀直接標(biāo)記分析CD34、CD44、CD90細(xì)胞表面標(biāo)志。用10μmmol/L的5-AZA誘導(dǎo)4周后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈類心肌細(xì)胞樣改變、透視電鏡觀察：細(xì)胞核呈橢圓形,胞漿內(nèi)可見成束的肌絲,肌絲內(nèi)可見梭形密體、豐富的糖原顆粒、大量的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)。免疫熒光組化染色體可見：GATA4, cTnI表達(dá)陽性的細(xì)胞。并檢測細(xì)胞β-肌球蛋白重鏈(β-MyHC)基因的表達(dá)。5-AZZ作用后細(xì)胞進(jìn)行生長周期分析以及生長曲線描記。結(jié)果顯示體外純化擴(kuò)增后的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞含有與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相同的細(xì)胞表面標(biāo)志,第三代以后細(xì)胞純度較高,經(jīng)5-AZA在體外誘導(dǎo)培養(yǎng),可形成心肌樣細(xì)胞,在誘導(dǎo)劑量作用后,基本的生物學(xué)特性未發(fā)生改變。 第二部分：將人的心肌細(xì)胞置于95%N2-5%CO2缺氧環(huán)境下培養(yǎng)造成模擬心肌缺血損傷模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡與缺氧呈時間依賴性,將人的心肌細(xì)胞和人臍血MSCs在缺氧環(huán)境下共同培養(yǎng),臍血MSCs具有抵抗缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡的能力。 第三部分：通過對體外長期培養(yǎng)、擴(kuò)增的臍血MSCs細(xì)胞和經(jīng)5-AZA誘導(dǎo)作用28天后的MSCs細(xì)胞的生長曲線和生長周期分析、細(xì)胞核型分析、端粒酶活性檢測、細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的檢測以及細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)來評價試驗(yàn)用臍血MSCs是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。結(jié)果證實(shí)：經(jīng)離體培養(yǎng)、擴(kuò)增臍血MSCs和經(jīng)5-AZA誘導(dǎo)分化成心肌樣細(xì)胞后不存在基因突變,不具有成瘤性。 第四部分：選擇6例急性心肌梗死的病人,在移植前1周,應(yīng)用干細(xì)胞動員劑,重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對進(jìn)行骨髓動員,然后用細(xì)胞分離儀對外周血單個核細(xì)胞分離純化。分離純化的單核細(xì)胞經(jīng)心導(dǎo)管在梗死相關(guān)動脈內(nèi)注射治療。干細(xì)胞移植術(shù)后進(jìn)行隨訪1、3、6月的心電圖、心臟超聲測定左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、心肌核素顯像。同時與對照組進(jìn)行比較。隨訪結(jié)果顯示：經(jīng)干細(xì)胞移植治療后的患者心功能明顯改善、心電圖上心肌梗死部位有小的R波、心臟內(nèi)存活細(xì)胞較多。 結(jié)論：(1)臍血成為繼骨髓之外的另一個MSCs來源。臍血MSCs為心肌細(xì)胞移植提供了良好的細(xì)胞供體,是心肌干細(xì)胞另一來源；(2)心肌細(xì)胞凋亡與缺氧呈時間相關(guān)性。人臍血MSCs和人的心肌細(xì)胞共同培養(yǎng),能有效抵抗缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡；(3)通過我們的實(shí)驗(yàn)建立了從細(xì)胞水平評價心肌細(xì)胞凋亡的方法；(4)臍血MSCs在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)具有正常MSCs細(xì)胞的生長速度；(5)在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)擴(kuò)增的臍血MSCs和經(jīng)過5-AZA向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)后的臍血MSCs沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化；(6)干細(xì)胞移植治療后的患者心功能明顯改善、心電圖上心肌梗死部位有小的R波、心臟內(nèi)存活細(xì)胞較多。
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【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 涂向東,張寶珍,朱忠勇;用吐溫20改進(jìn)骨髓細(xì)胞染色體制備方法[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2002年06期

2 朱洪生,連鋒,朱偉,鐘z，

本文編號：2361641