【摘要】： 登革病毒(dengue viruses, DV)屬于黃病毒屬(Flavivirus),根據(jù)E蛋白的抗原性不同,可分4種血清型(DV2 1-4)。它由主要由埃及伊蚊傳播,引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合癥。全世界大約有40 %的人居住在熱帶和亞熱帶地區(qū),屬于感染的高危人群。每年全世界大約有1億人感染登革出血熱,死亡率約為5 %。到目前為止,尚無安全有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防和特效抗DV藥物進(jìn)行治療�？梢奃V感染已是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。 DV2是有包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組全長約11 KD,編碼一個(gè)多肽鏈后,在宿主的信號(hào)肽酶和病毒編碼的蛋白酶作用下裂解為三種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM、E)和七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。在黃病毒屬蛋白酶作用其自身編碼的多聚蛋白底物的過程中,需要活化蛋白或者輔助因子使蛋白酶的達(dá)到最佳活性,目前認(rèn)為NS2B即是一個(gè)重要的輔助因子,在激活NS3蛋白酶和NS2B NS3異二聚體中發(fā)揮作用,因而成為研究者關(guān)注的靶點(diǎn)。 NS2B是亞細(xì)胞定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個(gè)膜內(nèi)蛋白。在相對(duì)區(qū)分NS2B疏水性區(qū)域的基礎(chǔ)上分為七個(gè)區(qū)域(Ⅰ-Ⅶ),其中,Ⅳ(G69-E80)為疏水的核心區(qū),能夠直接與NS3蛋白酶結(jié)合。其側(cè)面的兩個(gè)親水性區(qū)域(Ⅲ-Ⅴ),用突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)顯示NS2B的40個(gè)氨基酸圍繞在Ⅲ到Ⅴ區(qū),是最佳刺激NS3蛋白酶的活性區(qū)域。而且,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明,NS2B-NS3蛋白酶的活性也是由這個(gè)親水性片段介導(dǎo)的。目前,正在從分子學(xué)結(jié)構(gòu)證明NS2B輔助因子激活蛋白酶的活性機(jī)制。NS2B除了激活蛋白酶的活性外,還能促進(jìn)NS3與膜的融合,是NS3誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要輔助因子。 NS2B在病毒復(fù)制過程中的作用目前尚不十分清楚,重要原因之一是缺乏特異性的顯示手段,為進(jìn)一步研究NS2B蛋白在DV2感染過程中的作用和作為新檢測(cè)靶抗原的可能性,本課題構(gòu)建NS2B蛋白的原核和真核表達(dá)載體,經(jīng)過克隆、表達(dá)和純化,制備了抗NS2B的多克隆抗體,為下一步研究工作提供了免疫學(xué)工具。 本研究主要結(jié)果與結(jié)論如下: 一.DV2 NS2B蛋白的原核表達(dá)、抗血清的制備及其生物學(xué)特性的初探 1. NS2B的原核表達(dá)、抗血清的制備 利用RT-PCR以DV2 mRNA為模板擴(kuò)增出DV2 NS2B編碼基因NS2B。將NS2B全長基因插入原核表達(dá)載體pQE31,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,獲得的pQE-NS2B/ JM109工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,超聲裂解提取表達(dá)產(chǎn)物,融合蛋白NS2B以包涵體的形式存在。包涵體裂解液經(jīng)Ni-NTA親和純化后,獲得大小相符的特異目標(biāo)蛋白條帶。經(jīng)Western blot證實(shí)為所需目的蛋白。目的蛋白經(jīng)純化復(fù)性后免疫BALB/c小鼠,獲得了抗體效價(jià)較高的抗血清,經(jīng)ELISA檢測(cè),鼠抗血清效價(jià)達(dá)到了1:12800。利用Western blot和間接免疫熒光證實(shí),抗血清能特異性地識(shí)別DV2 NS2B蛋白。NS2B抗血清的成功制備為進(jìn)一步研究NS2B在DV2感染機(jī)制中的作用提供良好的工具。 2. DV2 NS2B多克隆抗體的生物學(xué)功能 通過PRNT檢測(cè),DV2 NS2B產(chǎn)生的抗血清中和病毒的作用不明顯,可能不具有免疫保護(hù)作用;收集DV2感染后不同時(shí)間點(diǎn)的ECV304細(xì)胞,免疫熒光檢測(cè)顯示:感染12 h后用NS2B抗血清能檢測(cè)到NS2B抗原,隨著感染時(shí)間的延長,NS2B蛋白在細(xì)胞內(nèi)的含量也隨著增加;激光共聚焦顯示:NS2B蛋白與NS3蛋白在感染12 h、24 h和48 h后的ECV304細(xì)胞核周和胞質(zhì)中有共存區(qū)域。 二、DVNS2B蛋白在真核表達(dá)載體的克隆、表達(dá)及其DNA免疫 1.真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-P7/NS2B的構(gòu)建 通過PCR擴(kuò)增出DV2 NS2B編碼基因。將NS2B全長基因插入真核表達(dá)載體pCAGGS,轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue,獲得pCAGGS-P7/NS2B XL-Blue工程菌。超純提取質(zhì)粒pCAGGS-P7/NS2B DNA后,利用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞Vero,間接免疫熒光染色顯示NS2B蛋白的表達(dá),該質(zhì)粒命名為:pCAGGS-P7/NS2B。 2. pCAGGS-P7/NS2B質(zhì)粒DNA免疫BALB/c小鼠 經(jīng)大規(guī)模超純提取質(zhì)粒pCAGGS-P7/NS2B DNA后,注射到BALB/c小鼠后,經(jīng)ELISA檢測(cè),鼠抗血清效價(jià)達(dá)到了1:2000,利用Western blot和間接免疫熒光證實(shí),DNA免疫產(chǎn)生的NS2B抗血清能特異性地識(shí)別DV2 NS2B蛋白。 本研究分別用原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載構(gòu)建的NS2B重組質(zhì)粒,分別以蛋白免疫和DNA免疫的方法,制備抗NS2B抗血清,并通過免疫學(xué)方法檢測(cè)證明這兩種方法產(chǎn)生的NS2B抗血清是能夠特異性識(shí)別DV2 NS2B蛋白。但兩種方法各有優(yōu)勢(shì):(1)用蛋白免疫產(chǎn)生的NS2B抗血清比DNA免疫產(chǎn)生的NS2B抗血清效價(jià)高,但存在蛋白純化、復(fù)性等較為煩雜的步驟;(2) DNA免疫所獲抗體效價(jià)略低,但方法較為簡(jiǎn)便,所產(chǎn)生抗體進(jìn)行免疫染色時(shí),幾乎無非特異性染色。相信在不久的將來,隨著DNA免疫原性的提高,這一方法將有有廣闊的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R373;R392

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本文編號(hào)：2359835