【摘要】： 日本血吸蟲病至今仍是一種嚴重危害公眾健康的公共衛(wèi)生問題。我國每年要投入大量的人力、物力防治血吸蟲病,但由于血吸蟲保蟲宿主多,釘螺分布廣且難以消滅,再感染頻繁發(fā)生,血吸蟲病的流行形勢仍十分嚴峻。上世紀70年代吡喹酮的問世,對血吸蟲病具有很好的治療效果,但并不能有效阻斷血吸蟲病的傳播,再感染使化療成本顯得相對昂貴,且大規(guī)模反復化療有產(chǎn)生抗藥性蟲株的潛在危險。由于血吸蟲在終宿主體內(nèi)不繁殖,只要能產(chǎn)生部分免疫保護作用就可有效降低成蟲負荷,減輕由蟲卵遲發(fā)型超敏反應引起的蟲卵肉芽腫及其纖維化病變所致嚴重病理損害,同時減少蟲卵對環(huán)境的污染,對控制血吸蟲病的流行傳播具有重要意義,因此需發(fā)展血吸蟲病疫苗作為化療的重要補充。DNA疫苗作為一種劃時代的新技術(shù),在抗血吸蟲感染領(lǐng)域已進行了大量研究,顯示了良好的應用前景。本實驗室已構(gòu)建的日本血吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)DNA疫苗,免疫小鼠獲得部分的保護作用,且在保蟲宿主豬研究中發(fā)現(xiàn)除具有抗感染作用外,還能減輕宿主肝臟蟲卵肉芽腫炎癥反應,肉芽腫平均面積明顯減小。TPI作為一疫苗候選分子,其抗原表位為血吸蟲所特有,與哺乳類TPI無免疫交叉反應,避免了自身免疫的危險,但其免疫保護作用仍不很理想,推測其原因之一可能與該疫苗抗原分子在體內(nèi)的表達量不高有關(guān)。由于宿主和寄生蟲基因密碼子使用上的偏性,外源抗原進入宿主后,外源基因似不能有效表達。據(jù)報道,對曼氏血吸蟲的SmGPCR基因進行了密碼子優(yōu)化,可顯著增加其表達量;在HIV和瘧疾等的研究中也有類似結(jié)果。體內(nèi)電穿孔是另一種提高目的抗原在細胞內(nèi)表達的方法,其可通過提高DNA疫苗在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率,進而提高抗原基因的表達,增強保護性免疫應答。熱休克蛋白(HSP)是生物界普遍存在的一類高度保守蛋白質(zhì),具有分子伴侶作用并參與抗原提呈過程,并可利用其自身的免疫原性來誘導宿主免疫殺傷。HSP作為分子伴侶,甚至可直接將結(jié)合的多肽抗原遞呈給T細胞,激活特異性CTL和記憶性T細胞,引發(fā)細胞免疫反應。本研究擬構(gòu)建含有密碼子優(yōu)化的TPI基因和mHSP70基因的DNA疫苗,觀察其免疫保護效果,同時進一步觀察體內(nèi)電穿孔技術(shù)對增強DNA疫苗免疫保護作用的效果,并初步探討其作用機理,。本研究內(nèi)容主要包括: 一、日本血吸蟲TPI基因密碼子優(yōu)化 按照哺乳動物的密碼子使用偏好,對日本血吸蟲TPI基因進行優(yōu)化,使用GeneOptimizer軟件對SjCTPI基因的253氨基酸中的208個氨基酸編碼基因進行優(yōu)化,但不改變氨基酸。根據(jù)密碼子優(yōu)化后的基因序列,由德國GENEART公司全基因合成優(yōu)化后的TPI基因(TPI.opt),然后插入pJW4303質(zhì)粒。 二、血吸蟲TPI基因密碼子優(yōu)化后的DNA疫苗的構(gòu)建 根據(jù)TPI.opt堿基序列設(shè)計合成引物擴增TPI.opt,再插入真核表達載體pcDNA3.1的多克隆位點,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TPI.opt。根據(jù)mHSP70堿基序列設(shè)計合成引物擴增mHSP70,插入質(zhì)粒pcDNA3.1,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mHSP70。根據(jù)TPI.opt(去除終止密碼子)堿基序列設(shè)計合成引物擴增TPI.opt,再插入重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mHSP70的mHSP70基因的上游,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70;根據(jù)TPI(去除終止密碼子)設(shè)計合成引物擴增TPI,再插入重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mHSP70的mHSP70的上游,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TPI-mHSP70。 三、血吸蟲TPI基因密碼子優(yōu)化DNA疫苗免疫保護作用的研究 60只BALB/c雌性小鼠隨機分為5組,A組(pcDNA3.1,空質(zhì)粒對照組)、B組(pcDNA3.1-TPI)、C組(pcDNA3.1-TPI-mHSP70)、D組(pcDNA3.1-TPI.opt)和E組(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70)。各組小鼠分別肌肉注射相應的純化質(zhì)粒DNA,每鼠100μg,每隔2周免疫1次,共3次。末次免疫后4周每鼠經(jīng)腹部皮膚攻擊感染(40±1)條日本血吸蟲尾蚴,42d后剖殺,計數(shù)成蟲及肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2天及感染前2天經(jīng)尾靜脈采血檢測IgG及IgG1、IgG2a的水平。攻擊感染前2d取小鼠脾臟制備單個脾細胞,采用流式細胞儀法檢測細胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF的水平。結(jié)果顯示D、E組減蟲率分別達到36.03%、39.03%,,減卵率分別達到41.71%、46.85%,均分別顯著高于B(減蟲率26.28%,減卵率28.35%)、C組(減蟲率28.38%,減卵率31.39%)(P＜0.01)。B、C、D、E組小鼠血清都檢測到特異性IgG及IgG2a,IgG1;IgG2a/IgG1的比值分別為1.73、2.06、2.44、3.09。D、E組小鼠的IL-2、IFN-γ、TNF較B、C、組均有明顯升高,但各組IL-4、IL-5均未檢測到。表明TPI基因密碼子優(yōu)化后的DNA疫苗相對于未優(yōu)化TPI DNA疫苗能誘導小鼠產(chǎn)生較高的免疫保護作用,且誘導宿主產(chǎn)生較強的以Th1為主的免疫應答。 四、體內(nèi)電穿孔技術(shù)增強密碼子優(yōu)化后的TPI DNA疫苗免疫保護作用的研究 60只BALB/c雌性小鼠隨機分為5組,A組為(pcDNA3.1,空質(zhì)粒對照組)、B組(pcDNA3.1-TPI.opt)、C組(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70),D組(pcDNA3.1-TPI.opt電穿孔)、E組(pcDNA3.1-TPI.opt-mHSP70電穿孔)。各組小鼠分別肌肉注射相應的純化質(zhì)粒DNA,每鼠100μg,每隔2周免疫1次,共3次,D、E組每次DNA疫苗免疫后即輔以體內(nèi)電穿孔。末次免疫后4周每鼠經(jīng)腹部皮膚攻擊感染(40±1)條日本血吸蟲尾蚴,42d后剖殺,計數(shù)成蟲及肝臟蟲卵數(shù)。首次免疫前2天及感染前2天經(jīng)尾靜脈采血檢測IgG及IgG1、IgG2a的水平。攻擊感染前2d取小鼠脾臟制備單個脾細胞,采用流式細胞儀法檢測細胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF的水平。結(jié)果顯示D、E組減蟲率分別達到49.74%、51.64%,,減卵率分別達到57.04%、61.42%,均非常顯著高于B、C組(P＜0.01)。B、C、D、E組小鼠血清都檢測到特異性IgG及IgG2a、IgG1;IgG2a/IgG1的比值分別為2.44、3.09、3.82、4.06。D、E組小鼠的IL-2、IFN-γ、TNF較B、C、組均明顯升高,但各組均未檢測到IL-4、IL-5。本實驗表明體內(nèi)電穿孔技術(shù)可顯著提高日本血吸蟲密碼子優(yōu)化后TPI DNA疫苗的免疫保護作用,減蟲率和減卵率均達到和超過50%。
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【學位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2357624