【摘要】： 目的:近年來(lái)大量的研究表明體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells ,BMSCs)可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞,因此BMSCs有望成為神經(jīng)細(xì)胞移植的種子細(xì)胞來(lái)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病,但體外BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的機(jī)制尚不清楚。隨著對(duì)神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中體內(nèi)產(chǎn)生的一些因子如:音猬因子(Sonic hedgehog,Shh)、維甲酸(Retinoic acids,Ra)等研究的不斷深入,提示了其可能在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化過(guò)程中起著重要的作用。故本課題采用Shh、Ra、福斯克林(Forskolin,Fn)聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs后的上清液再誘導(dǎo)BMSCs,觀察其向神經(jīng)細(xì)胞分化的情況,來(lái)探討該上清液的誘導(dǎo)分化作用及其產(chǎn)生促分化作用的機(jī)制。 方法:取健康成年志愿者骨髓4ml,以全骨髓培養(yǎng)法分離成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,以含20%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面CD45、CD90、CD105的含量以鑒定純度。以含有Shh、Ra、Fn的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)第三代的BMSCs,分別在6h、12h、24h、3d、5d和7d時(shí)收集誘導(dǎo)后培養(yǎng)液上清。以不同時(shí)間點(diǎn)的上清液誘導(dǎo)第五代的BMSCs為實(shí)驗(yàn)組(依次為6h上清組、12h上清組、24h上清組、3d上清組、5d上清組、7d上清組),設(shè)立陰性對(duì)照組:誘導(dǎo)液為DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基、陽(yáng)性對(duì)照組:誘導(dǎo)液為含有Shh、Ra、Fn的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基。觀察細(xì)胞形態(tài)變化并計(jì)數(shù),誘導(dǎo)7天后以免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定各組細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neural-specific enolase ,NSE)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neural-specific enolase ,MAP-2),以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達(dá),以鑒定是否誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞并計(jì)算分化百分率。各組間分化百分率進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。并用MTT法測(cè)定誘導(dǎo)后細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。使用ELISA法檢測(cè)誘導(dǎo)前培養(yǎng)體系上清(12h、24h、3d)和誘導(dǎo)前培養(yǎng)體系上清(12h、24h、3d)中NGF含量,觀察其變化。 結(jié)果:骨髓細(xì)胞接種2天后給予PBS沖洗,全量換液可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)。8~10天后細(xì)胞可基本鋪滿瓶底,為均一梭狀細(xì)胞。以1:3比例傳代,傳代后1天左右細(xì)胞可以恢復(fù)活力并貼壁生長(zhǎng),5~6天后可鋪滿瓶底。傳代至4~5代時(shí)細(xì)胞形態(tài)比較均一,混雜細(xì)胞較少。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD90、CD105陽(yáng)性而CD45陰性證明了BMSCs的純度。誘導(dǎo)1天后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,細(xì)胞收縮呈圓形并出現(xiàn)少量細(xì)胞突起。誘導(dǎo)3天后較多細(xì)胞出現(xiàn)單極或多極突起,有少量細(xì)胞突起相連呈網(wǎng)狀。5天后有少量細(xì)胞懸浮死亡,突起延長(zhǎng)多交織成網(wǎng)狀;7天時(shí)細(xì)胞形態(tài)與5天時(shí)基本相同,但懸浮死亡細(xì)胞較多。陰性對(duì)照組細(xì)胞仍呈均一長(zhǎng)梭狀細(xì)胞,但細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均有NSE、MAP-2表達(dá),但6h、12h、24h上清液誘導(dǎo)組NSE、MAP-2細(xì)胞陽(yáng)性率均較3d、5d和7d組高(P0.05),3d、5d和7d各組細(xì)胞陽(yáng)性率差異不顯著(P0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組、12h上清組細(xì)胞分化率大于6h上清組和24h上清組(P0.05);陽(yáng)性對(duì)照組、12h上清組細(xì)胞分化率無(wú)顯著差異(P0.05)、6h上清組和24h上清組分化率無(wú)顯著差異(P0.05)。12h上清組誘導(dǎo)后細(xì)胞生存狀態(tài)優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組(P0.05)。誘導(dǎo)后上清液各時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、3d)NGF濃度均明顯高于誘導(dǎo)前上清組(12h、24h、3d)(P0.01)。 結(jié)論 1、使用全骨髓培養(yǎng)法可以有效的從骨髓中分離BMSCs,并在體外擴(kuò)增。傳代培養(yǎng)至第4-6代時(shí)可獲得純度較高的BMSCs。 2、Shh、Ra、Fn聯(lián)合作用BMSCs后的上清液具有誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用,其中以12h上清液促進(jìn)分化作用最為明顯。 3、Shh、Ra、Fn三者聯(lián)合作用于BMSCs可促進(jìn)其分泌NGF到細(xì)胞外。 4、Shh、Ra、Fn三者在聯(lián)合作用于BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的過(guò)程中可能有重要的新物質(zhì)/中間物質(zhì)的產(chǎn)生。新物質(zhì)/中間物質(zhì)可能具有推動(dòng)分化或者維持分化進(jìn)行的作用。
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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 顧平,婁淑杰,王銘維,王彥永,鮑璇,何成,路長(zhǎng)林;骨髓基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)中腦神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年03期

2 胡慧敏;羅卓荊;胡學(xué)昱;丁坦;;音猬因子體外誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究[J];中國(guó)脊柱脊髓雜志;2006年05期

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本文編號(hào)：2357537