【摘要】： 人類呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)是各年齡組下呼吸道感染的主要病毒病原體之一,尤見(jiàn)于嬰幼兒、老年人及免疫缺陷病人等急性呼吸道感染住院者。世界衛(wèi)生組織已將研究RSV疫苗列為全球疫苗計(jì)劃的優(yōu)先發(fā)展項(xiàng)目之一。其中針對(duì)RSV的減毒活疫苗最具前景,因此我們計(jì)劃通過(guò)低溫連續(xù)傳代加化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)突變的方式使RSV毒力降低,然后用蝕斑法克隆分離單一純系的病毒株,用敏感動(dòng)物體內(nèi)接種法來(lái)檢測(cè)RSV毒力及免疫原性改變的情況,最終期望獲得在動(dòng)物體內(nèi)毒力很低但能有效誘導(dǎo)高水平免疫應(yīng)答的減毒株作為疫苗候選株。實(shí)驗(yàn)從研究?jī)?nèi)容上可分為針對(duì)RSV的基礎(chǔ)研究及低溫傳代減毒疫苗侯選株篩選兩部分。 第一部分針對(duì)RSV的一些基礎(chǔ)研究 此部分對(duì)RSV的一些基本特征進(jìn)行了探索。首先探討了不同細(xì)胞基質(zhì)對(duì)RSV病毒生長(zhǎng)情況的影響。在相同培養(yǎng)條件下,用單層KMB_(17)細(xì)胞、Vero細(xì)胞、Hep-2細(xì)胞及Hela細(xì)胞培養(yǎng)原代RSV,觀察并記錄病毒引起細(xì)胞病變的時(shí)間、病變的特點(diǎn),檢測(cè)培養(yǎng)物的感染性滴度,比較4種細(xì)胞基質(zhì)下RSV生長(zhǎng)繁殖的特點(diǎn)。結(jié)果顯示用KMB_(17)細(xì)胞培養(yǎng)RSV時(shí),于第6天開始出現(xiàn)細(xì)胞病變,第12天細(xì)胞病變面積超過(guò)細(xì)胞總面積的75%,觀察不到明顯的合胞體病變特征,感染性滴度達(dá)6.13 lg CCID_(50)/ml;用Vero細(xì)胞培養(yǎng)RSV時(shí),于第3天開始出現(xiàn)細(xì)胞病變,第8天細(xì)胞病變面積超過(guò)75%,可觀察到明顯的合胞體病變特征,感染性滴度達(dá)6.83 lg CCID_(50)/ml;用Hep-2細(xì)胞及Hela細(xì)胞培養(yǎng)RSV時(shí),于第5天開始出現(xiàn)細(xì)胞病變,第9天細(xì)胞病變面積超過(guò)75%,無(wú)明顯的合胞體病變特征,感染性滴度達(dá)6.83 lg CCID_(50)/ml。由此可知4種細(xì)胞基質(zhì)中KMB_(17)細(xì)胞對(duì)RSV相對(duì)不敏感;而Vero細(xì)胞對(duì)RSV較其它3種細(xì)胞敏感,在短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞可出現(xiàn)明顯病變,并達(dá)到較高滴度;Hep-2細(xì)胞及Hela細(xì)胞培養(yǎng)RSV的敏感性相近,較Vero細(xì)胞稍弱。 由于病毒在體外培養(yǎng)過(guò)程中,吸附時(shí)間及維持液的pH值可能對(duì)病毒的生長(zhǎng)產(chǎn)生較大影響。我們?cè)?7℃下將RSV吸附不同時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng),觀察吸附時(shí)間對(duì)病毒致細(xì)胞病變的影響。實(shí)驗(yàn)證明RSV經(jīng)37℃吸附0分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘后接種,對(duì)引起4種細(xì)胞病變的時(shí)間并沒(méi)產(chǎn)生明顯影響。另外配制pH6.4、pH6.6、pH6.8、pH7.0、pH7.2、pH7.4、pH7.6的細(xì)胞維持液用于培養(yǎng)RSV,比較在不同pH環(huán)境下病毒生長(zhǎng)所受的影響。可明顯觀察到,在一定范圍內(nèi)pH越高出現(xiàn)病變的時(shí)間越短;此外,當(dāng)pH值高于7.0時(shí),引起的細(xì)胞病變形態(tài)以細(xì)胞圓縮死亡為主,而pH低于7.0的環(huán)境下可觀察到較多合胞體的病變現(xiàn)象;同時(shí)發(fā)現(xiàn),RSV在pH7.2的維持液環(huán)境中生長(zhǎng),可獲得最高的感染性滴度,達(dá)6.63lg CCID_(50)/ml,說(shuō)明pH7.2左右的維持液較適RSV的生長(zhǎng)。 研究除了用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞病變的方法來(lái)檢測(cè)RSV,還嘗試了電鏡切片、間接免疫熒光法來(lái)檢測(cè)RSV。實(shí)驗(yàn)中取已出現(xiàn)細(xì)胞病變的KMB_(17)細(xì)胞和Vero細(xì)胞制成電鏡切片,觀察細(xì)胞在電子顯微鏡下的病變情況及病毒的存在與否,從照片上可看到RSV致兩種細(xì)胞病變的特點(diǎn)及許多類似病毒的顆粒。用間接免疫熒光法檢測(cè)病毒抗原,從照片上可看出在不同時(shí)段RSV在KMB_(17)細(xì)胞、Vero細(xì)胞和Hela細(xì)胞上分布的情況,其中Vero細(xì)胞上可見(jiàn)到較多RSV對(duì)應(yīng)的綠色熒光。 我們對(duì)RSV的動(dòng)物模型做了初步探索。先是將原代RSV通過(guò)注射途徑接種到小鼠及其乳鼠的腦內(nèi),培養(yǎng)觀察它們的生長(zhǎng)情況,到第14天時(shí)處死,解剖取腦和肺組織做病理切片(HE染色)。結(jié)果所有經(jīng)腦內(nèi)接種原代RSV的鼠飼養(yǎng)至第14天時(shí)全部存活,無(wú)明顯生長(zhǎng)異常的現(xiàn)象,病理切片上也未見(jiàn)病理學(xué)改變。表明小鼠腦組織不是RSV侵蝕的主要靶器官,不適合研究RSV毒力強(qiáng)弱。后通過(guò)滴鼻途徑接種原代RSV到豚鼠鼻腔,除觀察生長(zhǎng)情況及病理切片外,還檢測(cè)了豚鼠血清中和抗體的效價(jià),并用細(xì)胞培養(yǎng)法分離豚鼠肺部的RSV。結(jié)果豚鼠經(jīng)接種RSV后,在第7天、14天處死時(shí)體重明顯低于正常對(duì)照組,呼吸較正常對(duì)照組急促,病理切片顯示其已經(jīng)患有嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎;14天時(shí)豚鼠血清中可檢測(cè)到1:4稀釋的抗體效價(jià);而肺部組織可分離出低感染性滴度的RSV。所有結(jié)果顯示豚鼠可作為研究RSV毒力強(qiáng)弱的一種動(dòng)物模型。 第二部分低溫傳代減毒疫苗侯選株的篩選 本研究依據(jù)冷傳代培養(yǎng)病毒可以積累病毒株的溫度敏感效應(yīng)的原理(僅一部分病毒有此特點(diǎn)),通過(guò)接種RSV病毒至人胚肺KMB_(17)細(xì)胞上,在低溫下進(jìn)行持續(xù)傳代培養(yǎng)。用T特征實(shí)驗(yàn)(檢測(cè)病毒在允許溫度和限制溫度下的滴度差值)檢測(cè)各代病毒的溫度敏感特征。RSV在KMB_(17)細(xì)胞上于37℃下已經(jīng)擴(kuò)增了5代,病毒感染性滴度在6.0lgCCID_(50)/ml左右,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中這幾代病毒可作為原代病毒對(duì)照使用;到目前為止,RSV在KMB_(17)細(xì)胞上于32℃下已連續(xù)傳代至第20代,各代病毒病變的時(shí)間及收獲時(shí)間變動(dòng)都較大,病毒感染性滴度仍是圍繞6.0 lg CCID_(50)/ml上下波動(dòng),溫度敏感實(shí)驗(yàn)中RSV在允許溫度和限制溫度下的滴度差值最大僅為1.5lg CCID_(50)/ml,未發(fā)現(xiàn)明顯的溫度敏感性特征。 取低溫傳代第6代和第11代的RSV,用第一部分中接種原始代次RSV相同的方法經(jīng)滴鼻接種豚鼠,檢測(cè)毒力變化情況。結(jié)果顯示接種第6代和第11代病毒的豚鼠與陰性對(duì)照組相比,體重一致,呼吸正常,這兩個(gè)指標(biāo)均未發(fā)現(xiàn)明顯差異。但這兩代病毒同樣引起了豚鼠肺部強(qiáng)烈的間質(zhì)性肺炎,從病理?yè)p傷角度看,接種原代、第6代及第11代RSV的豚鼠在第7天時(shí)炎癥細(xì)胞均以呈結(jié)節(jié)狀和大片狀浸潤(rùn)為主,似乎病變更嚴(yán)重,在第14天炎癥細(xì)胞呈彌漫浸潤(rùn),接種這3代病毒的豚鼠的肺組織切片并未顯示出明顯不同。其中接種第11代RSV的一只豚鼠與其它相比,出血較明顯、肺泡結(jié)構(gòu)呈片狀壞死,并可見(jiàn)小部分肺泡代償性氣腫,這是否由動(dòng)物個(gè)體差異所致,還是病毒毒力所致尚不能確定。接種6代病毒的豚鼠14天時(shí)血清中可檢測(cè)到1:8的中和抗體效價(jià),而接種11代病毒的豚鼠14天時(shí)血清中可檢測(cè)到1:4稀釋的抗體效價(jià),可見(jiàn)第6代病毒在一定程度上更有效地刺激了豚鼠的體液免疫應(yīng)答。從它們肺組織中分離出與原始代次一致、4.0 lg CCID_(50)/ml左右低感染性滴度的RSV。以上結(jié)果提示,低溫傳代到第11代時(shí),尚沒(méi)有明顯的減毒特征,需要進(jìn)一步傳代。 綜上所述,本研究探討了RSV的一些最基本的特征,為優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件,研制理想的病毒疫苗株積累了初步的實(shí)驗(yàn)資料。另外對(duì)RSV進(jìn)行低溫傳代,并研究其毒力變化情況。從結(jié)果看來(lái),經(jīng)過(guò)20代的冷傳代,病毒在KMB_(17)細(xì)胞上的生長(zhǎng)時(shí)程變動(dòng)較大,還不具有溫度敏感特征。接種第6代和第11代病毒的豚鼠雖體重不再減輕,但仍患有強(qiáng)烈的間質(zhì)性肺炎,說(shuō)明RSV的毒力還需進(jìn)一步降低。與國(guó)際上一些比較好的RSV減毒活疫苗候選株的研制過(guò)程相比,還需對(duì)RSV增加低溫傳代次數(shù),并且在后期還要介入化學(xué)誘變劑加速其突變,經(jīng)蝕斑法克隆分離出具有明顯溫度敏感特征的毒株,這樣才能獲得理想的減毒活疫苗候選株。因此,本研究在研制減毒活疫苗的整個(gè)計(jì)劃中僅邁出了一小步,今后還有很多工作有待去完成。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2356310