【摘要】： DNA疫苗有許多獨特的優(yōu)勢,例如與重組蛋白或全腫瘤細胞疫苗相比,DNA疫苗易于操作的特點使它更易于大規(guī)模的生產(chǎn);可同時編碼多個免疫調(diào)節(jié)分子等。DNA疫苗的安全性在動物模型及人類臨床試驗中也得到了證實。更重要的是,機體很少出現(xiàn)中和質(zhì)粒DNA的免疫應(yīng)答,因此,DNA疫苗可以多次重復(fù)給藥。DNA疫苗對腫瘤及感染性疾病的預(yù)防及治療性作用在動物模型中已經(jīng)得到了證實,直接接種編碼腫瘤相關(guān)抗原的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)特異性的細胞及體液免疫應(yīng)答,產(chǎn)生的CTL細胞及抗體介導(dǎo)的細胞毒作用能抑制腫瘤生長。 然而,DNA疫苗應(yīng)用于人體時還面臨著許多困難,臨床試驗的結(jié)果總是不盡如人意。其中的原因之一是CD4~+T細胞不能有效的活化。免疫的DNA質(zhì)粒進入機體后,所表達的內(nèi)源性抗原將通過MHC I類加工途徑遞呈給CD8~+ T細胞。而CD4~+T細胞的活化對基因疫苗起著至關(guān)重要的作用:抗體類別轉(zhuǎn)換,特異性B細胞、T細胞擴增,記憶細胞的形成及機體其他免疫功能發(fā)揮都需要活化的CD4~+T細胞提供共刺激分子及細胞因子。因此,將抗原分子直接帶入MHCII類提呈途徑(如內(nèi)體、溶酶體)將使抗原由內(nèi)源性加工提呈途徑向外源性加工提呈途徑轉(zhuǎn)化,有效活化CD4~+T細胞,促進其提供共刺激分子及細胞因子。溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome associated membrane protein, LAMP)屬I型穿膜蛋白,主要定位于溶酶體外膜。新合成的LAMP分子通過C末端短胞漿尾中的識別序列YXX(?)((?)代表任意一親水性氨基酸)能特異性的靶向輸從細胞漿送至內(nèi)體/溶酶體。 人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)及Survivin是兩個腫瘤相關(guān)抗原,在結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等大多數(shù)腫瘤細胞中高表達,而在相應(yīng)的正常組織中基本不表達。hCG及Survivin高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及耐藥性密切相關(guān)。因此,基于這兩種分子的各種疫苗用于相應(yīng)腫瘤的免疫治療。CTP37-DT是由β-hCG的C末端37個氨基酸與白喉類毒素(DT)相連制備的亞單位疫苗。最近,CTP37-DT作為治療結(jié)腸癌的藥物已經(jīng)通過I期及II期臨床試驗。試驗證實該疫苗是安全的并且能延長進展期結(jié)腸癌患者的生存期。而關(guān)于Survivin的體內(nèi)及體外實驗都證實,機體能產(chǎn)生針對Survivin多肽的特異性殺傷性T細胞,例如在乳腺癌、白血病及黑色素瘤患者體內(nèi)都能檢測到Survivin多肽特異性的MHC-I類分子限制的效應(yīng)性T細胞。迄今為止,已經(jīng)確定了多個由HLA-A*0201或HLA-A*0301限制遞呈的表位,這些表位被用作特異性CTL應(yīng)答的靶標(biāo)。 大量實驗證實,新生血管的形成促進腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。VEGF及其受體(尤其是vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2)在生理性及病理性血管形成過程中發(fā)揮著重要的作用。VEGF及其受體在腫瘤組織中常常高表達,針對二者的抗體、免疫毒素、核酶、可溶性受體及小分子酪氨酸激酶抑制劑等在動物模型及臨床試驗中取得了良好的治療效果。因此,VEGFR2是治療腫瘤的又一理想靶標(biāo)。VEGFR2的胞膜外區(qū)含有7個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。第三個結(jié)構(gòu)域在最小的配受體結(jié)合單位中至關(guān)重要,將其移除后將導(dǎo)致配受體結(jié)合功能的完全喪失;第四結(jié)構(gòu)域在維持配受體的高結(jié)合力上起主要作用,刪除第四結(jié)構(gòu)域?qū)?dǎo)致結(jié)合率的驟減。 因此,我們將編碼β-hCG C末端37個氨基酸、Survivin的5個不同HLA限制性的CTL表位及VEGFR2包膜外區(qū)第三、第四結(jié)構(gòu)域氨基酸的堿基拼接起來作為編碼腫瘤復(fù)合抗原基因(HSV)并插入LAMP分子溶酶體內(nèi)腔與穿膜區(qū)之間,構(gòu)建DNA疫苗p-L/HSV,希望能通過LAMP分子的作用將腫瘤抗原靶向到MHC-II類提呈途徑。 用p-L/HSV及各組對照質(zhì)粒免疫小鼠,共免疫三次,最后一次免疫后三周行ELISPOT及殺傷試驗。ELISPOT數(shù)據(jù)提示,在腫瘤復(fù)合抗原人工合成的重疊肽(18aa /肽,重疊8aa)中,11、18、22、24號肽可刺激p-L/HSV組T細胞產(chǎn)生IFN-γ,且特異性T細胞數(shù)目明顯高于相應(yīng)對照組p-HSV(P0.05);當(dāng)4、8、9號肽刺激時,p-L/HS組IFN-γ的分泌量顯著高于p-HS組;p-L/V組可產(chǎn)生19、24號肽特異性T細胞分泌IFN-γ;相對于p-L/V組,p-L/HSV組產(chǎn)生更強的24號肽特異性免疫應(yīng)答。殺傷試驗中,當(dāng)效靶比為50:l時,以1-4號混合肽加載P815細胞作為靶細胞,p-L/HSV組的殺傷率約為p-HSV組的4倍;p-L/HS組對加載1-4號混合肽的P815細胞的殺傷率顯著高于p-HS組(P0.05);p-L/V組的特異性殺傷見于23-26號混合肽加載的P815細胞;當(dāng)靶細胞為1-4號混合肽加載的P815細胞時,p-L/HSV組脾細胞的殺傷率亦顯著高于p-L/HS組。間接ELISA結(jié)果顯示,p-L/HSV組能產(chǎn)生針對1-4,10-14,15-18,23-26號混合肽的特異性抗體,且隨著免疫次數(shù)的增加,抗體濃度逐漸增加,至第三次后達到最高值;p-L/HS組產(chǎn)生的針對hCG及Survivin的特異性抗體濃度(1-9號肽涵蓋抗原HS)顯著高于p-HS組;相對p-L/HS組而言,p-L/HSV組產(chǎn)生的1-4號肽特異性抗體顯著增加(P0.05)。 我們的實驗證實,通過LAMP分子將腫瘤抗原靶向到MCH-II類加工、提呈途徑中,可有效活化CD4~+T細胞,增強腫瘤DNA疫苗的細胞及體液免疫應(yīng)答;抗血管生成與抗腫瘤實質(zhì)相結(jié)合的腫瘤復(fù)合抗原作為疫苗的目的抗原能收到更好的免疫效果。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;A DNA vaccine against extracellular domains 1-3 of flk-1 and its immune preventive and therapeutic effects against H22 tumor cell in vivo[J];World Journal of Gastroenterology;2004年14期

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本文編號：2347215