【摘要】： 前言 間皮細胞是一種分布在漿膜腔的特殊類型上皮細胞,被覆于胸膜腔,心包腔,腹膜腔以及內(nèi)臟器官表面。直到最近的二十年人們才注意到間皮細胞在維持漿膜腔完整性及功能方面發(fā)揮重要作用。胸腔積液是臨床常見疾病,由于胸膜腔內(nèi)液體的分泌和重吸收之間的平衡紊亂所致。越來越多的證據(jù)表明間皮細胞能主動轉運水和電解質,繼而調(diào)節(jié)體腔內(nèi)的液體總量。 上皮鈉通道(ENaC)是鈉離子通過極化上皮細胞頂側膜的主要通路,目前已被克隆和進行特征研究。至今已克隆出五種ENaC亞單位,分別命名為α-,β-,γ-,δ-和ε-ENaC。ENaC通道依其組成亞單位的不同,表現(xiàn)的生物物理學特性也不盡相同。當利尿劑阿米洛利加入頂膜側的浴液內(nèi)時,10~(-6) M的濃度即能抑制Na~+的轉運。 間接證據(jù)表明在人類和綿羊壁層腹膜存在阿米洛利敏感性鈉通道。應用阿米洛利后跨間皮的電阻增加,表明可能存在阿米洛利敏感性離子轉運途徑,其可能參與腹膜透析期間的超濾過程和鈉的清除。通過對比上皮細胞的極化狀態(tài),可以推測ENaC通道蛋白表達在腹膜腔的漿膜側。已有證據(jù)表明存在于肺上皮細胞中的ENaC在肺泡液體清除率方面發(fā)揮重要作用,而有關間皮組織中的胸膜腔液體清除的機制目前尚不清楚。我們推測在人間皮細胞中有ENaC的表達,并成為阿米洛利敏感性跨間皮電阻的分子學基礎。 在本研究中,我們檢測了ENaC在人和小鼠間皮細胞中的表達。我們的研究結果首次表明了ENaC通道在人胸膜間皮細胞中有生化方面及功能性的表達,并能被細胞cAMP和cGMP上調(diào)�？梢杂纱送茰yENaC在調(diào)控胸膜腔液體轉運方面發(fā)揮重要作用,并參與胸腔積液的病理生理過程。 方法 細胞培養(yǎng)-NCI-H441細胞購自American Type Culture Collection(ATCC)。人胸膜間皮瘤M9K細胞系和人原代胸膜間皮細胞由Dr.Steven Idell提供(美國德州大學健康科學中心)。人胸膜間皮細胞提取于患有充血性心力衰竭病人的胸腔積液。H441和人原代胸膜間皮細胞用添加10%胎牛血清和抗生素的RPMI培養(yǎng)液(ATCC)進行培養(yǎng),M9K細胞則生長于Medium 199(Invitrogen)中。 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)-將長滿的M9K及人原代胸膜間皮細胞刮于冷的PBS液中,離心后置于-80℃保存。BALB/c雄性小鼠(Jackson Laboratory)充分麻醉后手術分離小鼠壁層胸膜組織。用TRIzol試劑盒(Invitrogen)根據(jù)使用手冊提取總RNA。采用一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen)在梯度熱循環(huán)儀(EppendorfScientific)中進行RT-PCR反應。PCR產(chǎn)物用DNA序列分析證實(DNA SequencingCore,UAB)。 Western blot-應用6%凝膠進行SDS-PAGE分離后,將蛋白轉染于PVDF膜上(Bio-Rad)。在含20mM Tris-Cl pH 7.5,0.5M NaCl,5%無脂肪凍干奶粉溶液中孵育1小時后,加入一抗,4℃過夜。二抗室溫孵育30分鐘。應用ECL試劑盒(Amersham)分析圖像,所用ENaC亞單位抗體的稀釋濃度為1:5000。 免疫熒光和共聚焦顯微鏡檢查-種于濾膜或玻片的細胞用3%福爾馬林(EMSciences)固定45分鐘,繼以0.5%Triton X-100孵育3分鐘。用α-,β-,γ-和δ-ENaC的多克隆抗體20μg/mL常溫下孵育細胞2小時,然后用Alexa Fluor 488羊抗兔IgG(H+L)10μg/mL(Invitrogen)常溫孵育細胞2小時,采用300 nM DAPI(Invitrogen)進行核染5分鐘。應用連有Olympus S97809相機的Olympus BX 50熒光顯微鏡獲取圖像。用共聚焦顯微鏡采集側視圖像。在Adobe PhotoShop CS3 extended中進行融合圖像分析。 尤斯灌流室-切除的胸膜組織置于尤斯灌流室(Physiologic Instruments)之前保存在生理鹽溶液中�？玳g皮短路電流由充以3 M KCl,4%瓊脂糖鹽橋的Ag-AgCl電極進行測定。用VCC-MC8電壓鉗放大器(Physiologic Instruments)測定短路電流,用Acquire and Analyse軟件進行數(shù)據(jù)分析(version 2.3,PhysiologicInstruments)。 爪蟾卵母細胞表達及雙電極電壓鉗記錄-成年雌性非洲爪蟾(XenopusExpress)充分麻醉后手術取出蛙卵,按1α:1β:1γ:1δ比例細胞內(nèi)注射以50 nl無RNase水溶解的hENaC cRNAs 25 ng,注射cRNA 48小時后應用雙電極電壓鉗技術記錄全細胞電流。應用TEV-200電壓鉗放大器(Dagan)進行爪蟾卵母細胞電壓鉗制和記錄電流,采用pCLAMP 10.0軟件(Molecular Devices)進行采樣和數(shù)據(jù)分析。 膜片鉗技術-將載有M9K細胞的玻片從培養(yǎng)皿中移出,放在置于倒置熒光顯微鏡(Leica DM IRB)的浴槽內(nèi)。應用Axopatch 200B放大器(Molecular Devices)進行系列阻抗和電容補償。記錄全細胞電流時保持電位-40mV,應用-100至+100mV,步階10 mV的電位進行電流電壓曲線分析。單通道電流記錄采用細胞貼附模式。采樣頻率為1-2 kHz,濾波頻率為0.3 kHz。 數(shù)據(jù)分析-所有數(shù)據(jù)結果采用均值±標準誤表示。采用單尾分析法應用Origin8.0軟件對實驗結果進行分析,P＜0.05被認為統(tǒng)計學差異顯著。 結果 RT-PCR結果顯示四種(α,β,γ和兩種δ)ENaC亞單位在人原代胸膜間皮細胞,人間皮瘤細胞系(M9K),和小鼠胸膜組織中有表達。另外,Western blot和免疫熒光檢查結果證實了α,β,γ和δENaC亞單位在人原代胸膜間皮細胞和M9K細胞中的蛋白水平表達。通過尤斯灌流室裝置在M9K單層細胞和小鼠胸膜組織中記錄到了一種能被阿米洛利抑制的短路電流。全細胞膜片鉗記錄結果顯示在M9K細胞中的ENaC樣通道,阿米洛利的IC_(50)值為21μM。這種陽離子通道對細胞外Na~+有很高的親和力(K_m值為53mM),其離子選擇性與ENaC相同,均為Li~+＞Na~+＞K~+。Li~+的單通道電導值為15 pS。四種ENaC亞單位在爪蟾卵母細胞中共同表達時能形成一種功能性的Na~+通道。另外,我們發(fā)現(xiàn)在小鼠胸膜組織中forskolin和細胞膜通透性的cGMP均能增加短路電流。 結論 研究結果證實了在M9K細胞,一種人胸膜間皮瘤細胞系,和小鼠胸膜組織中α-,β-,γ-,和δ-ENaC亞單位的mRNA及蛋白水平表達。利用尤斯灌流系統(tǒng)我們在小鼠胸膜組織和M9K單層上皮細胞中記錄到了一個阿米洛利敏感的,類似ENaC的短路電流。另外,利用全細胞和單通道膜片鉗技術我們對這種阿米洛利敏感的,高Na~+通透性的通道進行了特征性的研究。這些研究結果清楚的表明,由四個亞單位組成的ENaC通道,在胸膜間皮細胞中有生化學和功能性的表達,并能被細胞cAMP和cGMP上調(diào)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R33

【共引文獻】

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5 鄭克勤,劉新光,梁念慈;氨氯吡咪對重組人蛋白激酶CK2全酶的抑制動力學[J];中國藥理學通報;2004年04期

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7 黎運源,梁念慈,江麗,吳鐵,林小粵;二甲基氨氯吡咪誘導HL-60細胞分化(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2000年05期

8 韓清華 ,武冬梅,呂吉元,吳博威;六肽FRCRSFa對大鼠心室肌Na~+/Ca~(2+)交換的抑制(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2002年06期

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本文編號：2342244