【摘要】：馬皰疹病毒1型(equine herpesvirus type 1, EHV-1)是馬科動(dòng)物重要的病原,馬最為易感,通常會(huì)引起呼吸道疾病和病毒性流產(chǎn),嚴(yán)重時(shí)引發(fā)神經(jīng)性疾病。該病毒在世界范圍內(nèi)流行,對(duì)養(yǎng)馬業(yè)和賽馬業(yè)的危害很大。目前市場上廣泛使用的主要為滅活疫苗,無法產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫反應(yīng),免疫保護(hù)性較差。EHV-1所有毒株都可引起流產(chǎn),但只有個(gè)別毒株可以引起神經(jīng)癥狀。近些年來,由EHV-1引發(fā)的神經(jīng)性疾病出現(xiàn)的頻率越來越高。目前已經(jīng)證實(shí),EHV-1 DNA聚合酶第752位氨基酸的點(diǎn)突變決定其神經(jīng)致病性。本研究將EHV-1強(qiáng)毒RacL11株的DNA聚合酶第752位氨基酸用同源重組方法從神經(jīng)致病型(D752)突變?yōu)榉巧窠?jīng)致病型(N752),同時(shí)將其gC蛋白基因敲除,構(gòu)建了基因改造活疫苗L11_D752N△gC。在用綠色熒光蛋白基因EYFP取代聚合酶基因后,RacL11只能在表達(dá)聚合酶蛋白的細(xì)胞系RK13中生長,首次證實(shí)DNA聚合酶對(duì)EHV-1的體外復(fù)制是必需的。L11_D752N△gC在體外對(duì)RK13細(xì)胞的吸附能力相對(duì)于野毒顯著下降,病毒滴度下降約20倍,從細(xì)胞中胞吐的效率降低,但形成的空斑卻比野毒和gC蛋白修復(fù)株大10%(p0.0001)。進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀分析了不同突變株對(duì)馬成纖維細(xì)胞NBL6表面MHC-1分子的下調(diào)作用,首次發(fā)現(xiàn)gC蛋白可下調(diào)MHC-1表達(dá)水平,表明gC蛋白可能參與了EHV-1在宿主體內(nèi)的免疫調(diào)控。用小鼠做動(dòng)物模型對(duì)Lll_D752NAgC進(jìn)行了毒力和攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),L11_D752N△gC在體內(nèi)復(fù)制能力顯著下降,接毒后第2天肺組織中病毒滴度小于野毒滴度的0.01%,未造成明顯病理損傷,在接毒后28天用野毒進(jìn)行攻毒可有效阻止病毒復(fù)制,在攻毒后第2天肺組織中病毒滴度與PBS對(duì)照組相比下降約100倍。上述結(jié)果表明,構(gòu)建的重組病毒L11_D752N AgC毒力顯著減弱,但具有良好的免疫保護(hù)效果,有望成為安全有效的減毒活疫苗。 在自然流行的EHV-1毒株中,其DNA聚合酶的第752位氨基酸主要存在天冬酰胺(N752)和天冬氨酸(D752)兩種形式,該位點(diǎn)的突變可影響聚合酶的活性并足以決定病毒對(duì)宿主的神經(jīng)致病性。DNA聚合酶對(duì)EHV-1的復(fù)制是必需的,而第752位氨基酸位于聚合酶高度保守的結(jié)構(gòu)域內(nèi),該位點(diǎn)對(duì)DNA聚合酶的功能是否也是必需并不清楚。本研究通過細(xì)菌人工染色體和Red重組技術(shù)將該位點(diǎn)進(jìn)行了敲除,并對(duì)突變株L11△752gp2進(jìn)行了N752和D752兩種修復(fù)。L11△752gp2在體外可以正常增殖,形成的空斑大小和生長曲線與母源病毒以及兩個(gè)修復(fù)株沒有顯著性差異,但對(duì)靶向聚合酶的抗病毒藥Aphidicolin的敏感性顯著降低。上述結(jié)果表明,EHV-1 DNA聚合酶第752位氨基酸對(duì)病毒的體外復(fù)制是非必需的,但該位點(diǎn)的突變可以改變病毒對(duì)抗病毒藥Aphidicolin的敏感性。 藍(lán)舌病毒為呼腸孤病毒科成員,是引起牛羊等反芻動(dòng)物藍(lán)舌病的病原,為蟲媒病毒,主要依靠庫蠓傳播。通常認(rèn)為該病毒只存在于熱帶和亞熱帶地區(qū),但在2006年8月,藍(lán)舌病毒8型首次登陸歐洲北部,并大規(guī)模流行,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。藍(lán)舌病毒各血清型間交叉保護(hù)性很差,目前針對(duì)8型的疫苗主要為滅活疫苗,無法區(qū)分免疫和自然感染。馬皰疹病毒1型作為活病毒載體具有感染譜廣,容納外源基因能力強(qiáng),機(jī)體缺少抗載體免疫等優(yōu)勢,作為活病毒載體已經(jīng)得到了初步的應(yīng)用。本研究首先將克隆為細(xì)菌人工染色體的馬皰疹病毒1型RacH疫苗株進(jìn)行了啟動(dòng)子改造,并以此為載體構(gòu)建了可表達(dá)藍(lán)舌病毒8型VP2蛋白的重組病毒rH_VP2。在體外,rH_VP2形成的空斑顯著小于野毒RacH,但可達(dá)到與野毒相同的滴度,并可穩(wěn)定的表達(dá)VP2蛋白。該重組活載體疫苗有望成為藍(lán)舌病毒8型的新型標(biāo)記性疫苗。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2336873