【摘要】： 研究背景和目的 腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα, TNF-α)是一種多功能細胞因子,由單核細胞和巨噬細胞等分泌產(chǎn)生,在生物機體的各個反應(yīng)中具有重要作用,包括炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤與微生物感染等方面。TNF的生物學功能通過細胞表面相應(yīng)的受體來實現(xiàn)。TNF受體家族主要是Ⅰ型膜蛋白受體,TNF-α有兩類受體,分子量分別是55kD(TNFR-I)和75kD(TNFR-Ⅱ)。TNFR-Ⅰ廣泛分布于正常細胞膜以及多種腫瘤細胞膜表面,TNFR-Ⅱ主要分布于造血細胞和內(nèi)皮細胞。兩類受體的胞外區(qū)有28%的同源性,而胞內(nèi)區(qū)沒有同源性,提示兩者介導了不同的信號傳遞途徑。TNFR-Ⅰ參與介導細胞活化信號和增殖信號,誘導一氧化氮合成酶和白介素8的活性,活化NF-κB,亦可誘導凋亡、介導炎癥反應(yīng)、抗病毒、促進成纖維細胞增殖等；而TNFR-Ⅱ主要調(diào)控胸腺細胞的增殖,抑制造血和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞或中性粒細胞活性等。TNF/TNFR系統(tǒng)不僅是重要的炎癥因子,而且對細菌感染,某些自身免疫疾病和退化性疾病有保護功能。TNF與TNFR結(jié)合以后,一方面介導凋亡信號,在抗腫瘤和抗病毒感染中發(fā)揮重要作用,另一方面也參與自身免疫性疾病和敗血癥中對自身組織細胞的損傷。TNFR的生物學活性受諸多因素影響,包括遺傳和環(huán)境因素,細胞分化以及細胞因子網(wǎng)絡(luò)間的信息傳遞等。 TNF受體相關(guān)蛋白1(TNFR associated protein 1, TRAP 1)是在1995年鑒定出來的HSP90家族的一個成員,與腫瘤壞死因子1類受體的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。其結(jié)構(gòu)與熱休克蛋白75相似,主要定位于線粒體,在心臟肌原纖維、心臟細胞核、胰腺以及血管內(nèi)皮細胞表面也有定位。近年來研究發(fā)現(xiàn),TRAP1不但具有HSP90家族的共同特點,如在氧化應(yīng)激時保護細胞,維持線粒體膜穩(wěn)定、抑制活性氧的產(chǎn)生,避免凋亡；TRAP1還有不同于HSP90家族其他成員的獨特特點,在于其特有的LxCxE模序,該模序可與Rb蛋白的SV40 T抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合,在有絲分裂和熱休克應(yīng)激后,TRAP1可從線粒體轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi),并借此結(jié)構(gòu)域與Rb結(jié)合,參與輔助變性的Rb重新折疊,恢復其天然構(gòu)象及功能,因此,TRAP1可做為Rb的分子伴侶,協(xié)助其調(diào)控細胞周期的進程,而HSPs其他成員則沒有此模序及此功能。 熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)又被稱作“分子伴侶”(molecular chaperone),當細胞受到應(yīng)激因素作用或處于病理生理狀態(tài)下(如低氧、感染性炎癥、缺血等)均可誘發(fā)熱休克蛋白合成和表達增加。研究發(fā)現(xiàn),許多腫瘤細胞可高度表達或特異表達不同亞族的HSP,認為HSP的表達參與了基因調(diào)控及細胞周期調(diào)控,與腫瘤細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡有關(guān),并與癌基因和抑癌基因有著密切關(guān)系,可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后及機體對抗腫瘤藥物的耐藥性等有關(guān)。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),TRAP1雖然在多數(shù)腫瘤中高表達,在某些腫瘤如非小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌中反而低表達。后繼研究發(fā)現(xiàn)TRAP1在調(diào)節(jié)Rb/E2F1途徑中發(fā)揮重要作用,影響細胞周期進程中G1／S期的轉(zhuǎn)換。這一結(jié)果促使我們繼續(xù)研究TRAP1在腫瘤細胞中的相關(guān)基因和信號通路,以期發(fā)現(xiàn)TRAP1不同于其他分子伴侶的獨特特點,為治療提供新的靶點。 本研究運用人類寡核苷酸芯片技術(shù)篩選TRAP1在腫瘤細胞中的相關(guān)基因,選用高表達TRAP1的A549肺腺癌細胞系和低表達TRAP1的MDA-MB-231乳腺癌細胞系,該兩細胞系均為高度侵襲性,均表達Rb及E2F1。利用小干擾RNA技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在兩個細胞系中分別敲低和過表達TRAP1,進行16小時的常氧或缺氧處理,在兩個細胞系中分別比較在常氧和急性缺氧的初期,TRAP1表達高低不同所引起的相關(guān)基因的變化,將得到的差異表達基因列表上傳至在線生物信息學分析軟件進行基因功能注釋、歸納聚類并建立基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,研究TRAP1所影響的信號途徑,探索其在腫瘤發(fā)病機制中的作用。 材料和方法 1.細胞培養(yǎng)：用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染A549細胞,同時以scramble RNA做為陰性對照；而用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在MDA-MB-231中構(gòu)建長效穩(wěn)定過表達TRAP1細胞株,同時以空載體轉(zhuǎn)染該細胞做為陰性對照。即得到4組細胞株：A549/siRNA和A549/Scramble, MDA231/TRAP1+和MDA231/Mock。分別分組進行常氧或缺氧(0.1%02濃度)處理16小時。 2.收獲細胞,提取總RNA,用Taqman實時熒光定量RT-PCR檢測TRAP1表達水平,驗證轉(zhuǎn)染的效率。 3.體外擴增RNA并純化,與熒光染料耦合,每個樣本對應(yīng)一個對照RNA,即人類通用參照總RNA。耦合后再次純化,檢測RNA濃度。 4.對芯片進行紫外偶聯(lián)并預雜交、洗片、離心干燥備用。 5.將每個樣本和一個對照RNA以相同質(zhì)量混合加樣于同一張芯片上,置于42℃雜交20小時。次日洗片、離心干燥。 6.在暗室用GenePix(?) 4000B芯片掃描儀掃描芯片,每個樣本獲得一個圖像,用GenePix Pro 6.0軟件進行圖像分析,將圖像轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)保存。用GeneSpringTM GX10軟件對獲得的圖像數(shù)據(jù)進行分析。采用LOWESS方法對數(shù)據(jù)進行標準化、標記過濾、倍值過濾和表達水平過濾、采用對數(shù)值轉(zhuǎn)換,去除每張芯片上變異系數(shù)(CV)大于25%的數(shù)據(jù),設(shè)定比值改變(Fold change)2.0為篩選標準,獲得4個差異表達基因列表,即：常氧16小時后,A549/siRNA Vs A549/Scr, MDA231/TRAP 1+Vs MDA231/Mock;缺氧16小時后,A549/siRNA Vs A549/Scr, MDA231/TRAP1+Vs MDA231/Mock。 7.使用DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)在線數(shù)據(jù)庫對差異表達基因的注解、功能聚類、通路分析,再用pSTIING在線數(shù)據(jù)庫建立基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。 8.挑選6個差異表達基因,用Taqman實時熒光定量RT-PCR驗證芯片結(jié)果的可靠性。 結(jié)果 1. Taqman qRT-PCR顯示,常氧和缺氧下,A549/siRNA組TRAP1的表達水平均明顯低于A549/Scr組；而MDA231/TRAP1+組TRAP1的表達水平明顯高于MDA231/Mock組,說明在兩個細胞系中轉(zhuǎn)染均成功。 2.常氧處理16小時后,A549細胞的兩個比較組中有373個差異表達基因,其中A549／Scr組表達上調(diào)的基因198個,下調(diào)的175個；而MDA231的兩個比較組中有163個差異表達基因,在MDA231/TRAP1+組上調(diào)的基因91個,下調(diào)的72個,A549細胞的差異表達基因數(shù)目大于MDA231細胞；而在缺氧處理16小時后,A549細胞系差異表達基因數(shù)目為377個,其中在A549／Scr組226個上調(diào),151個下調(diào)；MDA231細胞系差異表達基因為421個,比在常氧時明顯增多。 3.經(jīng)DAVID在線功能聚類分析,敲低TRAP1基因時差異表達基因所參與的生物過程以及信號通路,與過表達TRAP1基因時差異表達基因所參與的生物過程以及信號通路基本相似,包括細胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫／炎癥反應(yīng)、血管生成、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號轉(zhuǎn)導、細胞粘附、凋亡調(diào)節(jié)、磷酸化、離子轉(zhuǎn)運和蛋白水解等方面。其中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細胞周期相關(guān)基因占的比例較大。 4.挑選的6個差異表達基因,用Taqman qRT-PCR實驗驗證了其表達水平與芯片結(jié)果一致,說明芯片結(jié)果基本可靠。 5.經(jīng)pSTIING在線進行基因相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化,TNF途徑、NF-κB途徑、Rho激酶途徑、JNK途徑和MAPK級聯(lián)反應(yīng)途徑受TRAP1的調(diào)節(jié)比較明顯。 結(jié)論 1. TRAP1在兩個細胞系中表達水平不同,其生理作用的重要性可能不同。在常氧下,TRAP1可能在正常表達有該蛋白的腫瘤細胞中發(fā)揮著更重要的作用,而低表達該蛋白的腫瘤細胞可能存在其他不依賴TRAP1的機制而促進腫瘤生長。 2.敲低TRAP1基因時差異表達基因所參與的生物過程以及信號通路,與過表達TRAP1基因時差異表達基因所參與的生物過程以及信號通路基本相似,證實了TRAP1所影響的生物通路。 3. TRAP1可能促進腫瘤細胞的細胞周期進程和增殖,與TNF途徑、Rho激酶途徑和G-蛋白偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導途徑有關(guān)。 4. TRAP1可激活天然免疫反應(yīng),激活補體途徑、調(diào)節(jié)巨噬細胞活性；也參與適應(yīng)性免疫反應(yīng),參與T／B細胞活化、調(diào)節(jié)T細胞分化,影響Th1或Th2細胞亞群分泌細胞因子。 5. TRAP1促進細胞的磷酸化過程,其中MAPK級聯(lián)反應(yīng)途徑發(fā)揮了重要作用。 6. TRAP1可能抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移,與細胞粘附相關(guān)基因的差異表達上調(diào)有關(guān)。 7. TRAP1可能促進腫瘤細胞血管生成,以滿足或維持局部腫瘤組織的血供,以盡快使腫瘤細胞擺脫缺氧狀態(tài)。 8. TRAP1對腫瘤細胞的凋亡無明顯促進或抑制的趨勢,有待進一步在具體腫瘤細胞中研究。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 Min-Fu Tsan;;Heat Shock Protein and Innate Immunity[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年04期

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本文編號：2334822