【摘要】： 第一部分晚期內(nèi)體／溶酶體定位的小G蛋白R(shí)ab7b抑制巨噬細(xì)胞TLR9刺激產(chǎn)生的促炎性因子和Ⅰ型干擾素 大量研究證明,TLR9的異�；罨瘏⑴c了多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的發(fā)病過(guò)程,。基于上述研究事實(shí),TLR9拮抗劑有望成為這些自身免疫性疾病防治的潛在靶點(diǎn)。為此,必須對(duì)于TLR9受體介導(dǎo)的效應(yīng)與相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制了解清楚,同時(shí),發(fā)現(xiàn)并鑒定TLR9信號(hào)通路新的負(fù)向調(diào)控因子也具有十分重要的意義。眾所周知,TLR9被活化后最終將被轉(zhuǎn)運(yùn)到晚期內(nèi)體／溶酶體中,但是對(duì)于TLR9在細(xì)胞中的這一重新定位過(guò)程到底有何生物學(xué)重要意義,目前還不十分清楚。Rab7b是本實(shí)驗(yàn)室從人樹(shù)突狀細(xì)胞cDNA文庫(kù)中通過(guò)隨機(jī)大規(guī)模測(cè)序得到的一個(gè)與Rab7高度同源的新型分子,因此命名為Rab7b。Rab7b是一類鳥(niǎo)苷三磷酸酶,其主要定位在細(xì)胞的晚期內(nèi)體和溶酶體中。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究表明,Rab7b通過(guò)促進(jìn)TLR4的溶酶體途徑降解以負(fù)向調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中TLR9的交聯(lián)可以通過(guò)ERK和p38途徑有效地抑制Rab7b的表達(dá)。相反,晚期內(nèi)體／溶酶體定位的Rab7b在細(xì)胞內(nèi)可以與TLR9共定位在溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMP1)陽(yáng)性的細(xì)胞器室內(nèi),Rab7b對(duì)于MyD88以及其下游信號(hào)并不存在調(diào)控效應(yīng),但是當(dāng)TLR9被活化后Rab7b通過(guò)直接促進(jìn)TLR9本身的溶酶體途徑降解的翻譯后修飾下調(diào)TLR9在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。相應(yīng)的,Rab7b抑制TLR9下游的MAPK和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的活性進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)TLR9誘導(dǎo)的TNF-α,IL-6等促炎性因子和IFN-β為代表的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。本研究結(jié)果提示,Rab7b通過(guò)促進(jìn)TLR9本身的降解從而抑制TLR9信號(hào)通路中多種信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子的活性,抑制由TLR9誘導(dǎo)的促炎性因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。該結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步深入研究TLR9觸發(fā)的生物效應(yīng)與相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制提高了新的線索和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分凋亡誘導(dǎo)蛋白LAPF負(fù)向調(diào)控TLR3和TLR9介導(dǎo)的促炎性因子和Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的效應(yīng)與機(jī)制研究 TLRs家族受體根據(jù)各自不同的亞細(xì)胞定位可以分成細(xì)胞膜表面的TLRs和細(xì)胞內(nèi)定位的TLRs兩大類。TLRs成員的不同空間分布可能存在一種與它們空間定位相關(guān)的調(diào)控新模式,為TLRs信號(hào)調(diào)控的機(jī)制研究提供了新的方向。本實(shí)驗(yàn)之前我們從人樹(shù)突狀細(xì)胞cDNA文庫(kù)中通過(guò)隨機(jī)大規(guī)模測(cè)序發(fā)現(xiàn)了的溶酶體相關(guān)的包含PH和FYVE結(jié)構(gòu)域的凋亡誘導(dǎo)蛋白LAPF并報(bào)道了其參與TNF-α誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程。LAPF與細(xì)胞內(nèi)定位的TLRs成員相近的亞細(xì)胞定位使我們考慮是否存在LAPF參與胞內(nèi)定位TLRs信號(hào)調(diào)控的可能。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LAPF可以負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞中胞內(nèi)定位的TLR3和TLR9的信號(hào)通路,但卻不能調(diào)控細(xì)胞膜定位的TLR4信號(hào)通路。小鼠原代巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LAPF可以抑制TLR3和TLR9介導(dǎo)的TNF-α,IL-6和IFN-β的產(chǎn)生,LAPF的這種負(fù)向調(diào)控效應(yīng)部分依賴于其包含的PH結(jié)構(gòu)域。不僅僅是細(xì)胞內(nèi)定位的TLRs,胞內(nèi)dsRNA識(shí)別受體RIG-I同樣受到LAPF的調(diào)控。由RIG-I介導(dǎo)識(shí)別的仙臺(tái)病毒感染巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-β也同樣被LAPF所抑制。熒光差異雙向凝膠電泳以及后續(xù)的蛋白質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)LAPF降低了細(xì)胞內(nèi)Calmodulin的總蛋白表達(dá)量。Calmodulin是細(xì)胞內(nèi)最重要的Ca2+結(jié)合蛋白,可以活化下游CamKII,而CaMKII在本實(shí)驗(yàn)室之前的工作中已經(jīng)被證明是TLRs信號(hào)完全活化所必須的。此外,LAPF也可以通過(guò)其PH結(jié)構(gòu)域與磷酸化的Akt相互結(jié)合從而促進(jìn)Akt的磷酸化。Akt的活化可以磷酸化下游底物GSK-3位于N-末端的抑制性絲氨酸磷酸化位點(diǎn),從而抑制GSK-3的活性。GSK-3活性被抑制后競(jìng)爭(zhēng)性地削弱了NF-κB依賴的促炎性因子的產(chǎn)生。因此,與TLR3和TLR9有相同亞細(xì)胞定位的LAPF通過(guò)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Calmodulin的表達(dá)量以及活化Akt/GSK-3信號(hào)通路從而負(fù)向調(diào)控TLR3／9介導(dǎo)的促炎性因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。該部分研究結(jié)果為細(xì)胞內(nèi)定位的TLR信號(hào)通路調(diào)控的分子機(jī)制的研究提供了新的認(rèn)識(shí)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2333151