【摘要】： 目的：通過(guò)密度梯度離心法分離兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal stem cells,BMSCs)行體外培養(yǎng),探討B(tài)MSCs體外培養(yǎng)后的生物學(xué)特性,并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞方向分化,觀察其成骨過(guò)程。方法：用2%戊巴比妥鈉以30mg／kg麻醉家兔后處死,分離雙側(cè)股骨、脛骨骨髓,利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)分離純化兔BMSCs,制備單細(xì)胞懸液,接種于含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液中,通過(guò)傳代擴(kuò)增,進(jìn)一步去除未貼壁的細(xì)胞,待細(xì)胞鋪滿瓶底近80%后,加入0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期第3代細(xì)胞,以1×107／L的細(xì)胞濃度接種于預(yù)置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為2組：實(shí)驗(yàn)組使用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液,定向誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化；對(duì)照組等量加入含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。兩組細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng),進(jìn)行細(xì)胞成骨分化觀察。主要觀察指標(biāo)：在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá),透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色,VON KOSSA染色和堿性磷酸酶染色檢測(cè)向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化情況,并作統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：用兔淋巴細(xì)胞分離液梯度離心結(jié)合貼壁法從骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞,接種于含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液。在接種后48小時(shí)貼壁,細(xì)胞形態(tài)為橢圓形,多角形及短梭形；72小時(shí)后出現(xiàn)散在的紡錘狀貼壁細(xì)胞；10-14天后形成克隆。BMSCs貼壁稀疏時(shí),長(zhǎng)梭形細(xì)胞的兩極朝向不規(guī)則,細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞之間往往通過(guò)突起相連接,約3周出現(xiàn)致密的貼壁細(xì)胞層,此時(shí)細(xì)胞的兩極開(kāi)始有規(guī)律的排列成束狀,有的呈漩渦狀。經(jīng)傳代擴(kuò)增,細(xì)胞進(jìn)一步純化,細(xì)胞形態(tài)為均一的長(zhǎng)梭形并呈漩渦狀排列,而且生長(zhǎng)速率加快,P1代細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為37小時(shí)。P3代細(xì)胞生長(zhǎng)潛伏期為3-4天,第4-6天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,2周后進(jìn)入平臺(tái)期。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34,CD45陰性,CD44陽(yáng)性。電鏡顯示BMSCs胞核呈類圓形或不規(guī)則型,核膜清晰,有1-2個(gè)核,染色質(zhì)較粗,胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富,細(xì)胞表面有絨毛。用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)第3代BMSCs第7天,可觀察到少許細(xì)胞由梭形變?yōu)槎嘟切�。隨著時(shí)間的增長(zhǎng),多角形的細(xì)胞逐漸增多并聚集成團(tuán),14天后Von Kossa染色出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié),堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性。對(duì)照組未見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié),堿性磷酸酶染色呈陰性。經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞堿性磷酸酶染色明顯,胞質(zhì)中陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉淀,堿性磷酸酶活性部位呈棕黑色。Vonkossa染色可見(jiàn)黑色的礦化結(jié)節(jié)顆粒,顆粒大小不均一,提示有礦化基質(zhì)沉積。骨誘導(dǎo)培養(yǎng)三周,免疫組化SP法可檢測(cè)到Ⅰ型膠原表達(dá),在結(jié)節(jié)周圍呈黃褐色,而對(duì)照組則未能表達(dá)。結(jié)論：(1)將兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量較高純度的干細(xì)胞,且周期短,重復(fù)性好,可作為組織工程學(xué)中種子細(xì)胞的重要來(lái)源。(2)地塞米松在骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中所誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞在形態(tài)和生物學(xué)特性上都較對(duì)照組更具有成骨細(xì)胞的特征,其ALP得活性和形成鈣結(jié)節(jié)的能力都強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞。(3)BMSCs在體外適合的條標(biāo)件下可以向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并可檢測(cè)到標(biāo)志物表達(dá)的特異性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 顧祖超,李起鴻,趙玉峰,周紅星;兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下的成骨特性[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年05期

2 袁風(fēng)紅;鄒耀紅;高愷言;俞可佳;;地塞米松對(duì)體外人骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及成骨分化的影響[J];中華風(fēng)濕病學(xué)雜志;2006年08期

3 楊柳,段小軍;骨組織工程學(xué)中種子細(xì)胞研究的前沿問(wèn)題[J];中國(guó)臨床康復(fù);2002年04期

4 馬云勝;秦書(shū)儉;劉樹(shù)輝;曹中偉;羅美;;大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)劑條件下的成骨能力[J];中國(guó)臨床康復(fù);2006年37期

5 劉大鵬,艾合麥提·玉素甫,阿孜古麗·吐?tīng)栠d,木和普里·穆合甫爾買合斯托夫;骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)和分化誘導(dǎo)[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2004年04期

6 劉宏偉,歐龍,龐勁凡,袁志萍;自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞用于牙周骨缺損移植的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2000年03期

7 劉杰 ,孫正義 ,曹蕾;地塞米松對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J];中華骨科雜志;2003年11期

8 魏寬海,裴國(guó)獻(xiàn),鄭磊,王前,金丹,胡罷生;地塞米松對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2001年04期

9 黃開(kāi);章慶國(guó);蔡國(guó)鋒;;成骨細(xì)胞與誘導(dǎo)劑對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖與成骨分化的影響[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2006年02期

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本文編號(hào)：2329051