【摘要】：目的: 通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討β-巰基乙醇(β-ME)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向神經(jīng)元細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的作用,并對(duì)Notch信號(hào)通路在此誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用進(jìn)行研究,從而為闡明MSCs定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)機(jī)制提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng):成年雄性SD大鼠,于無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨和脛骨,剪除骨兩端,用5ml L-DMEM沖洗骨髓腔,將含有骨髓的沖洗液經(jīng)Percoll分離液離心分離,計(jì)數(shù)細(xì)胞調(diào)整密度,按1×109/L接種于培養(yǎng)瓶中,50 ml/L(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳,37℃溫箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察原代、傳代細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀態(tài)。 2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化:細(xì)胞傳至第5代后按照Woodbury方案進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)和誘導(dǎo)。加入L-DMEM+1mmol/Lβ-ME+20%FBS預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)后,加入L-DMEM+5mmol/Lβ-ME進(jìn)行正式誘導(dǎo)。按照不同的誘導(dǎo)時(shí)間分為3組:A組:單純培養(yǎng)對(duì)照組;B組:正式誘導(dǎo)1小時(shí)組;C組:正式誘導(dǎo)5小時(shí)組。在倒置相差顯微鏡下對(duì)誘導(dǎo)前后細(xì)胞進(jìn)行觀察、照相。 3.神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定:對(duì)誘導(dǎo)前后細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)神經(jīng)前體細(xì)胞特異性標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE),膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和神經(jīng)巢蛋白(Nestin)的表達(dá),以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性,未著色為陰性。 4. MSCs誘導(dǎo)后的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察:應(yīng)用透射電鏡對(duì)誘導(dǎo)5h后的MSCs進(jìn)行觀察,并對(duì)比誘導(dǎo)前后MSCs各細(xì)胞器的變化。 5. MSCs誘導(dǎo)前后神經(jīng)元特異表型蛋白的檢測(cè):分別提取三組細(xì)胞的總蛋白,用westernblot方法檢測(cè)三組細(xì)胞NSE和NESTIN蛋白在誘導(dǎo)前后的表達(dá)變化。 6. Notch信號(hào)通路的檢測(cè):參照Trizol試劑說(shuō)明書提取各組誘導(dǎo)前后細(xì)胞的總RNA,測(cè)定提取總RNA的純度,采用Realtime-PCR測(cè)定三組細(xì)胞的Notch1、jagged1、Hes1、Hes5 mRNA的表達(dá)水平,建立Excel數(shù)據(jù)表應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果: 1.各組MSCs貼壁生長(zhǎng)情況良好,大部分細(xì)胞貼壁呈長(zhǎng)梭形。傳代后細(xì)胞形態(tài)和原代細(xì)胞相似,生長(zhǎng)加快。 2. MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化明顯,胞體收縮成錐形、球形,突起增多,表現(xiàn)出神經(jīng)元細(xì)胞樣形態(tài)。誘導(dǎo)后5小時(shí)具有神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,形成雙極或多極細(xì)胞,而且細(xì)胞的多個(gè)突起發(fā)出分支,相互交織成網(wǎng),此時(shí)形態(tài)也不再發(fā)生明顯改變,具有典型的神經(jīng)元細(xì)胞樣形態(tài)。 3.誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)元標(biāo)志物的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示:誘導(dǎo)后5小時(shí),NSE、NESTIN和GFAP的表達(dá)均呈陽(yáng)性,提示四組細(xì)胞在誘導(dǎo)后均轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元細(xì)胞。 4.透射電鏡下可見(jiàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞,突起明顯,胞核大,呈圓形或橢圓形,居于胞體中心,核染色淺,以常染色質(zhì)為主,核仁明顯,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富,核周可見(jiàn)大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和夾雜其間的核糖體及線粒體。 5. westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)前后神經(jīng)元特異表型蛋白的表達(dá):與A組對(duì)照相比,B組和C組均呈現(xiàn)NSE、NESTIN蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。(P0.05). 6.實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果顯示:三組細(xì)胞均表達(dá)Notch1、jagged1、Hes1、Hes5。三組細(xì)胞Notch1、Jagged1、Hes1、Hes5在誘導(dǎo)分化前后的表達(dá)有差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1.全骨髓貼壁和密度梯度離心法可以獲得較高活力的MSCs,傳代及換液法可以使MSCs得到純化并成功建立了穩(wěn)定的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)增殖體系。 2.經(jīng)形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元細(xì)胞特異性表型蛋白的鑒定,在本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)誘導(dǎo)條件下,MSCs可體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞。 3.在MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞的過(guò)程中,伴隨著Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的調(diào)節(jié)改變,提示Notch信號(hào)通路可能參與了MSCs向神經(jīng)元方向的誘導(dǎo)分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華北煤炭醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2328114