【摘要】： 臍帶血(Umbilical cord blood,UCB)中同時(shí)含有造血干細(xì)胞(Hematopoietic stemcells,HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),造血干細(xì)胞(UCB-HSCs)已被用于基因治療、腫瘤凈化和造血重建等方面,另一種干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB-MSCs),不僅可以作為滋養(yǎng)層細(xì)胞支持HSCs在體外的大規(guī)模擴(kuò)增,在造血移植過程中還能夠降低并發(fā)癥的發(fā)生率以及加速造血重建功能的恢復(fù)。因此,在一次原代實(shí)驗(yàn)中同時(shí)培養(yǎng)并收獲這兩種細(xì)胞具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是這兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)方式不同,UCB-HSCs為懸浮生長(zhǎng)而UCB-MSCs為貼壁生長(zhǎng),傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法很難在一次原代實(shí)驗(yàn)中同時(shí)培養(yǎng)并分別收獲兩種細(xì)胞。本文利用微載體為UCB-MSCs提供貼壁表面,尋找適宜的培養(yǎng)基來(lái)同時(shí)培養(yǎng)臍帶血中的兩種干細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后采用自由沉降的方法方便地將懸浮的UCB-HSCs和粘附在微載體上的UCB-MSCs兩種干細(xì)胞分離并收獲。 本文通過正交實(shí)驗(yàn)證實(shí)血清是原代UCB-MSCs在微載體表面成功貼附并生長(zhǎng)的重要影響因素,而在一般的血清培養(yǎng)中使用的是胎牛血清(FBS)等動(dòng)物血清,這種體系下培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞在臨床應(yīng)用時(shí)會(huì)有免疫排斥反應(yīng)等。本文從同一份臍帶血中提取了人自體血清,作為FBS的替代血清加入到培養(yǎng)基中,亦可同時(shí)收獲UCB-HSCs和UCB-MSCs,原代培養(yǎng)UCB-MSCs的成功率為71.4%。本文同時(shí)考察了不同血清用量對(duì)UCB-HSCs和UCB-MSCS體外擴(kuò)增的影響。細(xì)胞懸液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)及CD34~+細(xì)胞流式分析結(jié)果表明,隨著血清含量的增加,UCB-MSCs的擴(kuò)增能力略有增加,但是并無(wú)顯著性差異,而UCB-HSCs的擴(kuò)增效果在人自體血清含量為5.6%時(shí)最好。在96孔板培養(yǎng)體系(100μl)中,經(jīng)過六天培養(yǎng)可使UCB-HSCs擴(kuò)增1.88±0.33倍。
[Abstract]:Umbilical cord blood (Umbilical cord blood,UCB) contains both hematopoietic stem cells (Hematopoietic stemcells,HSCs) and mesenchymal stem cells (Mesenchymal stem cells,MSCs). Hematopoietic stem cells (UCB-HSCs) have been used in gene therapy, tumor purification and hematopoietic reconstitution. Another type of stem cell mesenchymal stem cells (UCB-MSCs) can not only be used as trophoblast cells to support the large-scale expansion of HSCs in vitro, but also can reduce the incidence of complications and accelerate the recovery of hematopoietic reconstitution function during hematopoietic transplantation. Therefore, it has important clinical application value to culture and harvest these two kinds of cells simultaneously in a primary experiment. However, the growth patterns of these two kinds of cells are different, UCB-HSCs is suspended growth and UCB-MSCs is adherent growth, the traditional culture method is difficult to culture and harvest two kinds of cells simultaneously in a primary experiment. In this paper, microcarriers were used to provide adherent surface for UCB-MSCs and to find suitable medium for simultaneously culturing two kinds of stem cells in umbilical cord blood. Two kinds of stem cells, suspended UCB-HSCs and UCB-MSCs adhered to microcarriers, were isolated and harvested by free sedimentation after culture. In this paper, it is proved by orthogonal experiment that serum is an important factor influencing the successful adhesion and growth of primary UCB-MSCs on the surface of microcarriers, but in the normal serum culture, the animal serum, such as fetal bovine serum (FBS), is used. In this system, the expanded cells in the clinical application will have immune rejection and so on. Human autologous serum was extracted from the same umbilical cord blood and added to the medium as a substitute for FBS. The success rate of primary culture of UCB-HSCs and UCB-MSCs, was 71.4. The effects of different serum dosage on UCB-HSCs and UCB-MSCS amplification in vitro were also investigated. The results of cell count and CD34~ cell flow analysis showed that with the increase of serum content, the amplification ability of UCB-MSCs increased slightly, but there was no significant difference. The amplification effect of UCB-HSCs was the best when the content of human autologous serum was 5.6. In the 96 well plate culture system (100 渭 l), the UCB-HSCs amplification was 1.88 鹵0.33 times after 6 days of culture.
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2322487