【摘要】： 目的與意義:幼稚型精原干細胞是一種同時具有能夠分化成為精子,或轉(zhuǎn)化成為具有多能干細胞能力的一種特殊的干細胞,其在體內(nèi)體外發(fā)生和凋亡的調(diào)節(jié)機制至今仍鮮有研究報道。在體內(nèi)發(fā)育過程中,睪丸支持細胞(Sertoli cell)是唯一在發(fā)育全過程與精原干細胞接觸的細胞,并以其獨特的結構和功能為精子發(fā)生提供適宜的微環(huán)境,其中Sertoli細胞分泌的SCF是調(diào)節(jié)精原干細胞增殖、抗凋亡的關鍵因子,而Sertoli細胞對精原干細胞的調(diào)節(jié)作用受到激素、細胞因子等許多復雜因素的影響。本研究擬將人胚胎Sertoli細胞作為研究主體,建立體外分離、純化和培養(yǎng)人胚胎Sertoli細胞的體系;在此基礎上,觀察不同濃度和不同作用時間雌二醇(β-estradiol)對人胚胎Sertoli細胞分泌干細胞因子(SCF)功能的調(diào)節(jié);同時,研究雌二醇作用于人胚胎Sertoli細胞與幼稚型精原干細胞共培養(yǎng)體系,從細胞和分子水平觀察雌二醇通過人胚胎Sertoli細胞對人幼稚型精原干細胞體外培養(yǎng)的調(diào)節(jié)。 材料與方法: 第一部分建立體外培養(yǎng)人胚胎Sertoli細胞體系:分離人胚胎Sertoli細胞,采用兩步酶消化法及自然去除生殖細胞的純化方法,對人胚胎Sertoli細胞進行接種與培養(yǎng)傳代至12代,并對傳代培養(yǎng)的純化Sertoli細胞進行形態(tài)學,細胞標記物及功能檢測,以證實培養(yǎng)細胞為具有生物學功能的Sertoli細胞; 第二部分檢測雌二醇對人胚胎Sertoli細胞體外表達SCF的調(diào)節(jié):通過RT-PCR及細胞免疫熒光染色對人胚胎Sertoli細胞進行雌激素受體(ER)檢測,并采用Realtime-PCR檢測在不同濃度雌二醇及其不同作用時間,對人胚胎Sertoli細胞SCF基因表達的調(diào)節(jié),并用細胞免疫熒光檢測雌二醇調(diào)節(jié)人胚胎Sertoli細胞SCF蛋白表達的能力; 第三部分雌二醇對人幼稚型精原干細胞體外擴增的調(diào)節(jié):在人胚胎Sertoli細胞與人幼稚型精原干細胞體外共培養(yǎng)體系中,對培養(yǎng)所得細胞進行生殖細胞標記物和多能性標記物檢測,通過5-溴,2'-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)整合實驗,檢測雌二醇在共培養(yǎng)體系中對人幼稚型精原干細胞體外增殖的調(diào)節(jié),用TdT介導的dUTP缺口末端標記技術(TUNEL)對雌二醇在人幼稚型精原干細胞凋亡過程中的作用進行初步研究。 結果:首先,檢測體外培養(yǎng)的人胚胎Sertoli細胞的分子標記為MIS+/c-Kit-/AP-,證明為純化的人胚胎Sertoli細胞;實驗結果顯示,濃度為100ng/ml的雌二醇對人胚胎Sertoli細胞的SCF產(chǎn)生有顯著促進作用,且這種作用在15min起效,在1h達到高峰并繼續(xù)維持。雌二醇也能促進SCF蛋白表達增高。體外建立人胚胎Sertoli細胞與人幼稚型精原干細胞共培養(yǎng)體系,培養(yǎng)所得精原干細胞經(jīng)標記物檢測為c-Kit+/SSEA-4+/Oct-4+,證實其為具有多能性的幼稚型精原干細胞。在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的雌二醇能誘導人胚胎Sertoli細胞產(chǎn)生SCF,與未添加雌二醇組比較,添加雌二醇組幼稚型精原干細胞BrdU整合陽性率顯著提高,證實雌二醇對間接提高幼稚型精原干細胞增殖能力有顯著促進作用;而且添加雌二醇組與未添加組及雌二醇與ER拮抗劑(ICI 182780)共同添加組比較,TUNEL整合率顯著下降,提示雌二醇能間接抑制幼稚型精原干細胞凋亡。 結論:本課題在細胞和分子水平上探討了雌二醇對人幼稚型精原干細胞增殖活性的影響機制。結果表明,本研究建立了穩(wěn)定的體外純化,培養(yǎng)及傳代人胚胎Sertoli細胞的體系;首次證實雌二醇能促進人胚胎Sertoli細胞表達SCF,具有劑量及時間依賴性;從細胞水平初步闡明了雌二醇通過調(diào)節(jié)SCF的產(chǎn)生間接調(diào)節(jié)人幼稚型精原干細胞增殖及凋亡的機制。也為進一步探討人精原干細胞在體內(nèi)的發(fā)育過程及增殖調(diào)控因素奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R321

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本文編號：2321530