【摘要】： 目的與意義:幼稚型精原干細(xì)胞是一種同時(shí)具有能夠分化成為精子,或轉(zhuǎn)化成為具有多能干細(xì)胞能力的一種特殊的干細(xì)胞,其在體內(nèi)體外發(fā)生和凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制至今仍鮮有研究報(bào)道。在體內(nèi)發(fā)育過(guò)程中,睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell)是唯一在發(fā)育全過(guò)程與精原干細(xì)胞接觸的細(xì)胞,并以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能為精子發(fā)生提供適宜的微環(huán)境,其中Sertoli細(xì)胞分泌的SCF是調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞增殖、抗凋亡的關(guān)鍵因子,而Sertoli細(xì)胞對(duì)精原干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用受到激素、細(xì)胞因子等許多復(fù)雜因素的影響。本研究擬將人胚胎Sertoli細(xì)胞作為研究主體,建立體外分離、純化和培養(yǎng)人胚胎Sertoli細(xì)胞的體系;在此基礎(chǔ)上,觀(guān)察不同濃度和不同作用時(shí)間雌二醇(β-estradiol)對(duì)人胚胎Sertoli細(xì)胞分泌干細(xì)胞因子(SCF)功能的調(diào)節(jié);同時(shí),研究雌二醇作用于人胚胎Sertoli細(xì)胞與幼稚型精原干細(xì)胞共培養(yǎng)體系,從細(xì)胞和分子水平觀(guān)察雌二醇通過(guò)人胚胎Sertoli細(xì)胞對(duì)人幼稚型精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的調(diào)節(jié)。 材料與方法: 第一部分建立體外培養(yǎng)人胚胎Sertoli細(xì)胞體系:分離人胚胎Sertoli細(xì)胞,采用兩步酶消化法及自然去除生殖細(xì)胞的純化方法,對(duì)人胚胎Sertoli細(xì)胞進(jìn)行接種與培養(yǎng)傳代至12代,并對(duì)傳代培養(yǎng)的純化Sertoli細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué),細(xì)胞標(biāo)記物及功能檢測(cè),以證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為具有生物學(xué)功能的Sertoli細(xì)胞; 第二部分檢測(cè)雌二醇對(duì)人胚胎Sertoli細(xì)胞體外表達(dá)SCF的調(diào)節(jié):通過(guò)RT-PCR及細(xì)胞免疫熒光染色對(duì)人胚胎Sertoli細(xì)胞進(jìn)行雌激素受體(ER)檢測(cè),并采用Realtime-PCR檢測(cè)在不同濃度雌二醇及其不同作用時(shí)間,對(duì)人胚胎Sertoli細(xì)胞SCF基因表達(dá)的調(diào)節(jié),并用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)雌二醇調(diào)節(jié)人胚胎Sertoli細(xì)胞SCF蛋白表達(dá)的能力; 第三部分雌二醇對(duì)人幼稚型精原干細(xì)胞體外擴(kuò)增的調(diào)節(jié):在人胚胎Sertoli細(xì)胞與人幼稚型精原干細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系中,對(duì)培養(yǎng)所得細(xì)胞進(jìn)行生殖細(xì)胞標(biāo)記物和多能性標(biāo)記物檢測(cè),通過(guò)5-溴,2'-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)整合實(shí)驗(yàn),檢測(cè)雌二醇在共培養(yǎng)體系中對(duì)人幼稚型精原干細(xì)胞體外增殖的調(diào)節(jié),用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)對(duì)雌二醇在人幼稚型精原干細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用進(jìn)行初步研究。 結(jié)果:首先,檢測(cè)體外培養(yǎng)的人胚胎Sertoli細(xì)胞的分子標(biāo)記為MIS+/c-Kit-/AP-,證明為純化的人胚胎Sertoli細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,濃度為100ng/ml的雌二醇對(duì)人胚胎Sertoli細(xì)胞的SCF產(chǎn)生有顯著促進(jìn)作用,且這種作用在15min起效,在1h達(dá)到高峰并繼續(xù)維持。雌二醇也能促進(jìn)SCF蛋白表達(dá)增高。體外建立人胚胎Sertoli細(xì)胞與人幼稚型精原干細(xì)胞共培養(yǎng)體系,培養(yǎng)所得精原干細(xì)胞經(jīng)標(biāo)記物檢測(cè)為c-Kit+/SSEA-4+/Oct-4+,證實(shí)其為具有多能性的幼稚型精原干細(xì)胞。在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的雌二醇能誘導(dǎo)人胚胎Sertoli細(xì)胞產(chǎn)生SCF,與未添加雌二醇組比較,添加雌二醇組幼稚型精原干細(xì)胞BrdU整合陽(yáng)性率顯著提高,證實(shí)雌二醇對(duì)間接提高幼稚型精原干細(xì)胞增殖能力有顯著促進(jìn)作用;而且添加雌二醇組與未添加組及雌二醇與ER拮抗劑(ICI 182780)共同添加組比較,TUNEL整合率顯著下降,提示雌二醇能間接抑制幼稚型精原干細(xì)胞凋亡。 結(jié)論:本課題在細(xì)胞和分子水平上探討了雌二醇對(duì)人幼稚型精原干細(xì)胞增殖活性的影響機(jī)制。結(jié)果表明,本研究建立了穩(wěn)定的體外純化,培養(yǎng)及傳代人胚胎Sertoli細(xì)胞的體系;首次證實(shí)雌二醇能促進(jìn)人胚胎Sertoli細(xì)胞表達(dá)SCF,具有劑量及時(shí)間依賴(lài)性;從細(xì)胞水平初步闡明了雌二醇通過(guò)調(diào)節(jié)SCF的產(chǎn)生間接調(diào)節(jié)人幼稚型精原干細(xì)胞增殖及凋亡的機(jī)制。也為進(jìn)一步探討人精原干細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程及增殖調(diào)控因素奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R321

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本文編號(hào)：2321530